研究背景:翻译后修饰(posttranslational modifications,PTMs)是通过共价方式在蛋白质特定残基上连上一个或多个化学基团或其它蛋白质,其广泛参与细胞的信号传导,对调控细胞过程和命运有不可或缺的作用。在数百种已知的PTMs中,泛素化修饰参与调节真核生物的多种细胞进程,特PR-171研究购买别是在感受细胞内环境稳态变化或外源性刺激后进一步调节包括免疫应答在内对多种反应。尽管细菌不编码典型的泛素系统,但很多重要的病原体通过劫持宿主泛素网络,以达到利于自身成活和增殖的目的。例如:条件致病菌嗜肺军团菌通过Dot/Icm分泌系统向宿主细胞内转运数百个效应蛋白,包括编码多种泛素连接酶或去泛素化酶活性的效应蛋白。此外,军团菌还通过SidEs家族(SidE,Sde A,Sde B和Sde C)介导的非经典泛素化修饰调节多种宿主蛋白活性,以促进其胞内成活和生长。SidEs蛋白首先通过其单ADP核糖转移酶(mono-ADP-ribosyltransferase,m ART)结构域(R-S-EXE)水解NAD~+,将ADP核糖基团(ADPR)转移至泛素第42位精氨酸(Arg42)上生成ADP核糖基化泛素(ADPR-Ub)。随后SidEs蛋白上的磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)结构域剪切ADPR-Ub中的磷酸二酯键,生成AMP和磷酸核糖基泛素(phosphoribosyl ubiquitin,PR-Ub),后者同时被连接到底物蛋白的丝氨酸羟genetic drift基上,形成一种独特的泛素化修饰类型——磷酸核糖基泛素化。研究目的:SidEs催化泛素化的过程中,其中间产物ADPR-Ub有可能在被军团菌感染的细胞中积累。此外,效应蛋白Dup A/Dup B通过非经典去泛素化酶的活性,将PR-Ub从SidEs修饰的底物蛋白上切割下来。无论是ADPR-Ub还是PR-Ub均不能用于经典泛素化反应。本研究的目的是探讨军团菌感染的细胞内生成的PR-Ub是否会被降解或转化为天然Ub并阐明其机制研究方法与结果:(1)表达并纯化多种军团菌效应蛋白,在体外与PR-Ub共同孵育,并在反应中加入真核细胞裂解液,利用ADPR抗体检测PR-Ub是否可被逆转为ADPR-Ub。结果显示,PR-Ub与Lpg2527基因编码的蛋白LnaB共同孵育,在添加宿主总蛋白后,可以检测到ADPR-Ub生成,而与其他蛋白如MavK(Lpg2525)共同孵育并不能导致反应中生成ADPR-Ub。未加真核细胞裂解液或者加入煮沸后的细胞裂解液的PR-Ub与LnaB体外共同孵育体系中不产生ADPR-Ub。这些结果表明,LnaB可以催化PR-Ub转变为ADPR-Ub,但其催化活性可能需要源Pidnarulex分子式于宿主的辅助因子参与。(2)进一步通过免疫沉淀结合蛋白质谱的方法,发现LnaB可以在真核细胞中与肌动蛋白形成复合物。通过等温滴定量热法(ITC)检测发现,LnaB与肌动蛋白有较强的结合能力(Kd=～1μM)。通过ADPR抗体检测、质谱检测以及~(32)P-a标记的ATP实验发现,LnaB在有肌动蛋白和ATP存在的情况下,可以催化PR-Ub生成ADPR-Ub。此外,在没有PR-Ub的反应体系中,LnaB发生自修饰。与此一致,AMPPNP、ATPαS和ATPγS等ATP类食物可以替代ATP介导催化反应的发生,而Ap Cpp与LnaB和肌动蛋白的体系并不能催化PR-Ub生成ADPR-Ub。这些结果表明,LnaB在肌动蛋白存在的情况下,表现出一种独特的单磷酸腺苷酸化酶(AMPylator)活性,水解ATP催化PR-Ub发生单磷酸腺苷酸化(AMPylation)修饰,生成ADPR-Ub。进一步研究发现,LnaB单磷酸腺苷化修饰其肽链上的第196位酪氨酸(Tyr196)和第247位酪氨酸(Tyr247)。重要的是,同时将这两个氨基酸位点突变成丙氨酸(Ala)后,则完全丧失了单磷酸腺苷化酶活性,即不能将AMP基团转移至PR-Ub或自身。(3)利用PSI-BLAST分析发现LnaB蛋白序列中含有一个存在于多肽类毒素、分泌毒力蛋白的未知功能结构域,S-Hxxx E(x,任意氨基酸)。突变LnaB中的这一结构域中的丝氨酸(Ser261)、组氨酸(His305)或谷氨酸(Glu309)导致其PR-Ub单磷酸腺苷酸化活性的完全丧失。此外,已有研究表明LnaB高效激活NFkB信号通路,本研究发现S-Hxxx E结构域对于其激活NFkB信号通路十分重要。随后本研究验证了含有S-Hxxx E结构域的其他毒力蛋白是否依赖于该结构域表现出酶活性。构建半乳糖诱导的爱德华氏菌毒力蛋白(WP＿015869719.1)和伯克霍尔德氏菌毒力蛋白(WP＿006755655.1)表达载体,转化至酵母中验证这个潜在的催化结构域对其酵母毒性的影响。结果显示,野生型蛋白可抑制酵母的生长,而突变S-Hxxx E结构域任意一个氨基酸的突变体虽然在酵母中稳定表达,但完全丧失了对酵母的毒性。这些结果表明,S-Hxxx E作为毒力蛋白的一个功能结构域,可能具有催化底物发生单磷酸腺苷酸化或其它类似的酶活。(4)最后,本研究通过同源重组构建了敲除lna B的军团菌突变体菌株△lna B,通过感染实验发现LnaB缺失导致嗜肺军团菌感染的细胞中PR-Ub蓄积。结合我们合作者的研究结果,我们发现Mav L协同LnaB将PR-Ub转化为天然状态且具备生化活性的Ub,从而保持感染细胞中的泛素稳态。综上,本研究揭示了一种新的蛋白质单磷酸腺苷化修饰机制,它能被来自不同细菌病原体的毒力因子所利用。这一发现为更好的了解这一类病原体致病机制打开了一扇门,也为治疗和预防这一类病原体造成的感染奠定了基础。