目的:丁基苯酞(dl-3-n-butylphthalide,dl-NBP)治疗脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)的具体机制尚不明确。本研究通过体内实验探究dl-NBP抗凋亡和抗铁死亡作用,并进一步通过体外实验探讨dl-NBP是否介导趋化因子受体4(Cysteine-X-Cysteine chemokine receptor 4,CXCR4)发挥对CIRI的保护作用。揭示丁基苯酞药理作用及新作用靶点,为脑缺血再灌注损伤的治疗提供新思路。方法:1.动物实验:成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,体重在220-240 g,制备短暂性大脑中动脉栓塞(Transient middle cerebral artery occlusion,t MCAO)模型,诱导缺血性卒中(Ischemic stroke,IS),模拟体内CIRI。造模后,免疫荧光(Immunofluorescence,IF)观察CXCR4在大鼠脑组织表达和定位情况。SD大鼠随机分为以下3组,假手术组(Sham),模型组(t MCAO)和给药组(dl-NBP+t MCAO)。平衡木长170 cm,宽2 cm,距离地面高度1 m,所有大鼠在造模前3天训练走平衡木,1天2次。给药组在模型建立成功后2 h时腹腔注射80 mg/kg剂量dl-NBP,连续7天。给药7天后,进行改良大鼠神经功能缺损评分(Modified neurological severity score,m NSS)和墙角实验,评估大鼠神经功能缺损程度。完成上述行为学评价后,完整取出大脑,切成2 mm厚的脑片,用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色法检测各组大鼠脑梗死体积,采用干-湿重法检测大鼠脑水含量变化,selleck采用蛋白免疫印迹试验(Western blot,WB)检测大鼠脑组织中凋亡特异性标志蛋白Bax、Bcl-2、剪切型Caspase-3(Cleaved Caspase-3)以及铁死亡标志蛋白酰基辅酶a合成酶长链家族成员4(Acyl-Co A synthetase long-chain family member 4,ACSL4)、谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione Peroxidase 4,GPX4)、胱氨酸/谷氨酸反向转运体(Cystine/glutamate reverse transporter,x CT)表达情况。2.细胞实验:高分化的大鼠肾上腺嗜铬细胞(PC12)离体后表现出在体内的交感神经功能,被广泛用于各种中枢神经系统疾病的离体研究。我们以PC12细胞为研究对象,建立体外氧糖剥夺/复氧(Oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)模型模拟体外CIRI,分为OGD 0 h组、2 h组、4 h组、6 h组、8 h组和12 h组,以测定其缺糖、缺氧持续时间。用细胞计数试剂盒(Cell counting kit-8,CCK-8)测定以上不同糖氧剥夺时间点细胞活力。然后将细胞分为Sham组、OGD/R组、0.1 u M dl-NBP+OGD/R组、1 u M dl-NBP+OGD/R组、10 u M dl-NBP+OGD/R组和100 u M dl-NBP+OGD/R组,CCK-8检测细胞活力确定dl-NBP体外用药浓度。为了确定dl-NBP的作用,将细胞分为Sham组、OGD/R组和dl-NBP+OGD/R组,用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)、免疫印迹试验检测各组凋亡细胞所含比例和凋亡标志蛋白的表达水平。检测各组细胞丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量和铁离子评估脂质氧化水平和铁离子含量水平,免疫印迹试验确定各组铁死亡标志蛋白表达量。Alisertib小鼠为了探究dl-NBP是否介导CXCR4发挥CIRI的保护作用,用不同浓度(1 u M,5 u M,10 u M,20 u M)CXCR4抑制剂AMD3100预处理细胞24 h,WB检测细胞中CXCR4表达量,确定AMD3100的最佳药物浓度。将细胞分为Sham组、OGD/R组、dl-NBP+OGD/R组和AMD3100+dl-NBP+OGD/R组,流式细胞术、免疫荧光、Western blot评价各组细胞凋亡水平;MDA、铁离子、Western blot评估铁死亡水平。结果:1.动物实验:造模后,大鼠脑梗死体积、脑水含量、m NSS评分、墙角试验右转向次数百分比明flow mediated dilatation显升高,差异具有统计学意义。dl-NBP腹腔注射7天后,明显减小梗死体积,降低脑水含量,感觉、运动等神经功能明显好转,差异具有统计学意义。WB结果提示,t MCAO组大鼠脑组织促凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Bax表达、Bax/Bcl-2以及铁死亡标记物ACSL4表达显著升高,而抗凋亡蛋白Bcl-2和抗铁死亡蛋白GPX4、x CT表达明显下降,dl-NBP治疗后,明显逆转Cleaved Caspase-3、Bax、ACSL4升高和Bcl-2、GPX4、x CT下降的趋势,差异具有统计学意义。2.细胞实验:CCK-8结果表明,OGD 6h细胞活力下降50%且当dl-NBP浓度为10 u M时具有最佳治疗效果。经OGD/R刺激后,明显下调Bcl-2表达水平,而与Bcl-2相反,Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平和Bax/Bcl-2比值明显升高,流式细胞术结果提示PC12细胞经OGD/R后早期凋亡和晚期凋亡细胞百分比明显增高。而dl-NBP干预降低了Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平和Bax/Bcl-2比值,并且明显下调早期凋亡细胞的比例。OGD/R组细胞相比于Sham组,MDA水平、铁离子含量和ACSL4表达量明显升高,GPX4和x CT表达明显降低,dl-NBP治疗明显降低MDA水平、铁离子含量和ACSL4表达,升高GPX4和x CT表达,以上结果均具有统计学意义。用20 u M浓度CXCR4抑制剂AMD3100预处理细胞24 h,细胞中CXCR4水平下降50%,因此选择20 u M浓度的AMD3100预处理细胞。免疫荧光、WB和流式细胞术结果显示,与dl-NBP单独给药相比,CXCR4抑制剂AMD3100联合用药明显升高Cleaved Caspase-3的荧光强度和蛋白表达,升高Bax蛋白水平和Bax/Bcl-2比值,明显降低Bcl-2表达,同时上调PC12细胞凋亡比例。MDA检测、铁离子含量检测、WB实验结果说明,dl-NBP显著降低细胞脂质氧化水平、铁离子含量和ACSL4蛋白表达水平,显著上调GPX4和x CT的表达水平,而CXCR4被抑制后,明显逆转上述趋势,结果具有统计学意义。结论:1.dl-NBP在体内通过抗凋亡和铁死亡保护脑缺血再灌注损伤。2.在体外dlNBP依旧具有抗凋亡和抗铁死亡的作用。3.dl-NBP的抗凋亡和抗铁死亡作用是介导CXCR4发挥的。