纳米药物设计是提高化疗药物疗效和降低毒副作用的重要手段,但相较于传统小分子药物,肿瘤组织渗透、细胞摄取和药物释放等是限制纳米药物临床治疗效果的主要因素。因此,发展主被动双重靶向纳米药物,对克服多重递送障碍,从而提高疗效具有重要意义。本文选用壳寡糖(Chitosan oligosaccharides,COS)为载体材料,通过引入γ-聚谷氨酸(Poly(γ-glutamic acid),γ-PGA)、苯硼酸(phenylboronic acid,PBA)以及二硫键,赋予纳米体系主被动双重靶向特性。分别考察了在不同pH、活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)、谷氨酰胺转移酶(Gamma-glutamyl transpeptidase,GGT)和谷胱甘肽(Glutathione,GSH)等条件下阿霉素(Doxorubicin,DOX)响应性释放,以及在乳腺癌(MCF-7)、宫颈癌(He La)和肝癌(HepG2)细胞内的毒性作用、摄取分布与内吞作用途径等,研究其肝癌靶向特异性药物递送机制。本文研究分以下三个方面:(1)在COS、硝酸铈铵(Ceric ammonium nitrate,CAN)、PBA与丙烯酸N,N-二乙基氨基乙酯(N,N-diethyl aminoethyl acrylate,DEAEA)的摩尔比为1:1:1:1时,通过原子转移自由基聚合法成功合成了PBA-COS,并以三聚磷酸钠(Sodium tyipolyphosphate,TPP)为离子交联剂,制备pH/ROS/GGT主被动双Wnt-C59生产商重靶向性纳米粒子(PBA-COS/γ-PGA NPs),分别考察了原料浓度、转速和反应时间对PBA-COS/γ-PGA粒径和电位的影响,初步探讨纳米粒子的体外药物释放性能。结果表明,PBA-COS、TPP和γ-PGA浓度对粒径和电位的影响较大,当C_(COS)、C_(TPP)和C_(γ-PGA)分别为0.75、2.00和1.50 mg/m L,反应时间为3 h,搅拌速率为600 rpm时,PChiral drug intermediateBA-COS/γ-PGA NPs的粒径为141.60 nm,Zeta电位值为-19.60 m V。当C_(DOX)为1.00 mg/m L时,PBA-COS/γ-PGA NPs对DOX的包封率高达93.74%,载药率高达28.84%,粒径为164.20 nm,电位为-11.40m V。DOX@PBA-COS/γ-PGA在模拟肿瘤微环境(pH 6.5、100μM H_2O_2和10 U/m L GGT)中的药物释放率(90.36%)远高于正常组织环境(pH 7.4)下的释放率,约为其的2.22倍。(2)进一步考察了pH/ROS/GGT主被动双重靶向性纳米载药体系对MCF-7、He La和HepG2细胞的靶向选择特异性,并分别研究了纳米粒子在肿瘤微环境(pH、H_2O_2、GGT)下的细胞毒性和摄取作用。结果表明,相比于MCF-7和He La细胞,DLY-188011OX@PBA-COS/γ-PGA NPs对HepG2细胞表现出相对较强的作用效果,IC_(50)低至0.26μg/m L,且GGT敏感性显著优于PBA敏感性;在pH 6.5、10μM H_2O_2和10 U/m L GGT条件下培养24 h后,DOX@PBA-COS/γ-PGA NPs在HepG2细胞内的摄取作用显著增强,荧光强度达到7.62×10~5,是MCF-7和He La细胞中荧光强度的1.58和1.48倍。DOX@PBA-COS/γ-PGA NPs在HepG2细胞内培养3 h后出现溶酶体逃逸情况,8 h后能成功从溶酶体逃出进入细胞核发挥作用;DOX@PBA-COS/γ-PGA NPs在细胞内的摄取具有温度依赖性,且在HepG2细胞中网格蛋白介导的内吞作用占主导地位,而当加入GGT后,微管聚合/水泡运输介导的内吞作用增强,说明GGT响应性药物递送与微管聚合/水泡运输介导的内吞作用有关。(3)为提高载药效率,并防止DOX在正常生理环境中过早泄露,实现肿瘤中高效富集,本研究将DOX与二硫键连接制备GSH响应性前药DOX-ss和主被动双重靶向增强型PBA-COS-ss-DOX/γ-PGA NPs。PBA-COS-ss-DOX/γ-PGA NPs具有良好的生物相容性,在模拟肿瘤微环境(pH 6.5、10 m M GSH,100μM H_2O_2和10 U/m L GGT)中的药物释放率显著提高,约为正常组织(pH 7.4)时的6.87倍;且PBA-COS-ss-DOX/γ-PGA NPs在pH 6.5、10 m M GSH、10μM H_2O_2和10 U/m L GGT条件下的细胞毒性最强,荧光强度约为pH 7.4时的2倍,具有良好的GSH响应性,且该条件下的ROS强度远大于正常条件时的ROS强度,表明二硫键的引入能够通过氧化还原诱导肝癌细胞产生ROS,这将为后续研究做出有效铺垫。