黄酮糖苷类化合物是植物中一类重要的次生代谢产物,其苷元和糖基部分通过C-C或C-O键相连。与氧苷相比,黄酮碳苷类化合物具有刚性的C-C键,因此在哺乳动物体内具有很强的抗胃肠道水解酶代谢的稳定性以及生物活性,包括抗氧化、抗病毒、抗糖尿病、抗肿瘤和降压等活性。另外,它们还在保护植物免受食草动物、稻瘟病菌、干旱胁迫和紫外线辐射等方面发挥重要作用。目前,商品化的黄酮碳苷主要从植物中提取,这严重限制了它们的可用性和可持续性。同时该类成分的结构复杂性也bacteriochlorophyll biosynthesis给化学合成带来了巨大的挑战。因此,解析黄酮碳苷的生物合成途径,深入了解相关酶(尤其是查尔酮合酶和C-糖基转移酶)的特更多性对于它们在未来生物技术领域中的应用至关重要。目前,关于种子植物中黄酮碳苷生物合成途径的解析已较为清晰,但在孢子植物尤其是蕨类植物中还未被鉴定,因此挖掘蕨类植物中的关键酶也是当前需要解决的关键问题。乌蕨(Stenoloma chusana)为鳞始蕨科(Lindsaeaceae)乌蕨属(Stenoloma)植物,民间常用于治疗各种癌症、外伤出血、痢疾和农药中毒等,素有“万能解毒药”之美誉。成分研究表明,乌蕨中富含黄酮类化合物,包括多种黄酮碳苷类,如荭草苷、牡荆素以及相应的糖苷衍生物。因此,本研究以乌蕨为研究对象,对黄酮碳苷类化合物生物合成途径上的几个关键酶进行体外功能鉴定、晶体结构解析及合成生物学等研究。主要内容如下:(1)乌蕨查尔酮合酶ScCHS1的功能鉴定及晶体结构研究本文从乌蕨的转录组数据库中筛选得到1个功能注释为查尔酮合酶(Chalcone synthase,CHS)的基因,命名为ScCHS1。序列比对结果显示ScCHS1与其他植物来源CHSs的氨基酸序列相似度较高;在系统发育进化树中,ScCHS1与蕨类植物CHS聚为一簇,位于种子植物CHS分支的根部。因此,利用纯化后的蛋白进行体外酶活功能鉴定,结果表明ScCHS1能够分别以对羟基肉桂酰辅酶A(p-coumaroyl-CoA)、肉桂酰辅酶 A(cinnamoyl-CoA)、咖啡酰辅酶 A(caffeoyl-CoA)和阿魏酰辅酶 A(feruloyl-CoA)为底物,催化产生柚皮素、乔松素、圣草酚和高圣草素,底物选择性较广泛。不同于已报到的大多数查尔酮合酶,ScCHS1对苯环上含有甲氧基取代的feruloyl-CoA表现出明显的底物偏好性。并且酶活动力学检测结果也进一步确定ScCHS1的最适底物为feruloyl-CoA,其催化效率约为对p-coumaroyl-CoA的13倍。为解析其催化机制,我们采用X-射线衍射的方法对ScCHS1-apo及与各种产物(乔松素、柚皮素和圣草酚)和辅酶A的复合晶体结构进行解析,分辨率均达到2.2 A左右。同时,结合定点突变实验,在位于黄酮B环的结合口袋附近找到了 4个影响其底物选择性的关键氨基酸。从结构角度解释了 CHS对底物的选择性并为该类酶的研究提供了新的视角。(2)乌蕨ScCHS1在黄酮类化合LBH589作用物合成生物学中的应用为了将ScCHS1更好的应用于合成生物学研究,我们从乌蕨的转录组数据中筛选出2个可能的4-香豆酸:辅酶A连接酶(4-coumarate:coenzyme A ligase,4CL)基因,分别命名为Sc4CL1和Sc4CL2。序列比对和进化树分析发现Sc4CLs与种子植物4CLs之间高度同源并被归为种子植物中不同的4CL家族。体外酶活结果也进一步证实了它们进化地位不同造成催化活性上的差异。其中,Sc4CL1能够将肉桂酸(cinnamic acid)、对羟基肉桂酸(p-coumaric acid)、咖啡酸(caffeic acid)和阿魏酸(ferulic acid)分别酯化为相应的辅酶.A硫酯,而Sc4CL2除了对p-coumaric acid不具有催化活性外,对其他三个底物都具有酯化功能。因此,将Sc4CL1作为候选基因,在大肠杆菌中和ScCHS1共表达,以ferulic acid为底物,两步法合成高圣草素;并通过发酵条件的优化,使最高转化率达到98%以上。此外,将ScCHS1与Sc4CL1、ScCHI1(查尔酮异构酶,chalcone isomerase)、PaFNS I1(黄酮合酶Ⅰ,flavone synthase Ⅰ)联用,通过在大肠杆菌中饲喂不同的底物,异源合成B环上含有邻二酚羟基或甲氧基取代的黄酮类化合物。(3)乌蕨中C-糖基转移酶的挖掘与功能鉴定通过分析黄酮碳苷在乌蕨各组织中的分布情况并结合基因的表达水平,我们最终在乌蕨的转录组数据库中筛选出4个可能的C-糖基转移酶(C-glycosyltransferase,CGT)基因。体外酶活结果表明只有ScCGT1对根皮素、2-羟基柚皮素和2-羟基圣草酚表现出C-糖基化活性,分别产生nothofagin(根皮素3′-C糖苷)、牡荆素/异牡荆素和荭草苷/异荭草苷。尽管ScCGT1在体外表现出Ⅰ型CGT的功能,但序列比对结果显示ScCGT1中不含有用于鉴别Ⅰ型CGT特征的DPFXL基序;并且在进化树中ScCGT1与Ⅱ型CGT聚为一簇。因此,为研究其催化特点,我们结合结构模拟和氨基酸定点突变实验找到一个具有高催化效率的突变蛋白ScCGT1-P164T,并通过结构比对推测Thr氨基酸通过氢键作用稳定了糖供体的构象从而促进了蛋白的活性。此外,关于植物F2Hs与CGT基因在大肠杆菌中共表达来生产黄酮碳苷的研究较少,目前仅存在两项相关的报道,他们均采用截断的F2H(黄烷酮2-羟化酶,flavanone 2-hydroxylase)基因与P450还原酶(Cytochrome P450 Reductase,CPR)偶联在大肠杆菌中为CGT的催化提供反应中间体。在本研究中,我们将具有F2H活性的2-ODD可溶性蛋白CjFNS I/F2H与ScCGT1-P164T在大肠杆菌中结合,实现柚皮素向牡荆素和异牡荆素的高效转化。同时,与前期的研究相比,我们也简化了碳苷类化合物在大肠杆菌中的生物合成途径。这是首次在非种子植物中发现的CGT基因,也为利用酶促反应和代谢工程等方法高效合成碳苷类化合物提供了候选基因和研究策略。综上,本论文鉴定了一个新型的查尔酮合酶(ScCHS1)和首个非种子植物的C-糖基转移酶(ScCGT1),并对ScCHS1和ScCGT1的功能和催化机制进行了全面的研究。本文对于研究植物次生代谢产物合成关键酶进化提供了一定的参考意义,并填补了关于此类活性成分在非种子植物中合成途径领域的研究空缺。