乙肝病毒X基因突变的人肝癌细胞稳转株的构建及其生物学行为变化

目的 构建稳定表达乙肝病毒X基因（HBx）突变（C1653T、T1753C）的HepG2、Huh7细胞株，探讨突变点对肝癌细胞生物学行为的影响。方法以含HBx的pLVX-HBx-IRES-tdTomato质粒为模板，点突变合成pLVXHBx C1653T-IRES-tdTomato、pLVX-HBx T1753C-IRES-tdTomato慢病毒质粒。双酶切和Sanger测序的方法鉴定重组质粒的准确性。空白HepG2、Huh7细胞为对照组，pLVX-HBx-IRES-tdTomato、pLVX-HBx C1653T-IRES-tdTomato、pLVX-HBx T1753C-IRES-寻找更多tdTomato慢病毒液感染HepG2、Huh7细胞，0.6μg/mL嘌呤霉素筛选单克隆细胞进行扩大培养。免疫染色和Western blot法检测X蛋白（HBX）的表达鉴定稳转株的构建；Pollutant remediationCCK-8法测定细胞的增殖能力；Western blot法检测细胞中EMT相关信号分子的表达情况。两组间进行独立样本t检验。结果 双酶切和Sanger测序结果显示重组慢病毒质粒酶切后片段大小正确，点突变位置及碱基替换正确，成功构建pLVX-HBx-IRES-tdTomato、pLVXHBx C1653T-IRES-tdTomato、pLVX-HBx T1753C-IRES-tdTomato慢病毒质粒。免疫染色及Western Blot结果显示转染HBx及突变型的HepG2、Huh7细胞均有HBX表达，空白对照组均无HBX表达，成功获得稳定表达HBx、HBx C1653T和HBx T1753C的HepG2、Huh7细胞稳转株。增殖实验表明HBx及突变型均较对照组明显促进肝癌细胞的增殖（P<0.01），而HBx C1653T突变较HBx进一步促进肝癌细胞的增殖（P<0.05）。同时HBx C1653T突变明显上调N-cadherin的表达、下调E-cadherin的表达，促进了上皮间质转化（epithelial to mesenchymal transition, EMT）MAPK抑制剂的发生。结论 成功获得稳定表达HBx、HBx C1653T和HBx T1753C的人肝癌细胞HepG2、Huh7细胞稳转株；HBx C1653T突变可导致肝癌细胞的增殖能力增强及EMT发生。