研究背景:肝癌主要指原发性肝癌,病理类型以肝细胞癌为主,是临床上一种很常见的恶性肿瘤。据2020年版全球癌症统计,肝癌是全球第六大常见肿瘤,是癌症相关死亡第三大常见原因。在我国,新发病例约占全球45%,相关死亡约占47%。二甲双胍是临床上2型糖尿病的一线用药,21世纪以来,人们陆续发现其对多种包括肝癌在内的肿瘤具有防治作用。目的:肿瘤发生发展与细胞凋亡失衡有关,研究发现死亡受体(Fas、TNFR1、DRs)在肝癌细胞上表达异常。本课题研究以HepG2肝癌细胞株为研究对象,探索二甲双胍是否可以通过Fas L/Fas、TNFα/TNFR1、TRAIL/DRs三条外源性凋亡途径促进肝癌细胞凋亡。方法:(1)CCK-8法检测不同浓度的二甲双胍作用于HepG2细胞不同时间后细胞活性变化;(2)CCK-8法检测不同浓度的二甲双胍联合三种促凋亡因子(Fas L、TNFα、TRAIL)作用于HepG2细胞后细胞活性变化;(3)Annexin V/PI法、caspase-3试剂盒分别检测10 m M浓度的二甲双胍联合促凋亡因子对HepG2细胞凋亡的调控作用和caspbiomarkers and signalling pathwayase-3活化的影响;(4)qPCR技术检测10 m M浓度二甲双胍对HepG2细胞上死亡受体介导的凋亡通路相关基因的调控作用;(5)Western Blot技术检测不同浓度的二甲双胍对HepG2细胞上死亡受体介导的凋亡通路相关蛋白的调控作用。结果:(1)用不同浓度的二甲双胍处理HepG2细胞24 h、48 h、72 h后,1 n M、10n M、100 n M、1μM、10μM、100μM和1 m M二甲双胍组细胞活性未见显著下降(P>0.05),10 m M组细胞活性下降显著(P<0.05),并表现出时间依赖性(P<0.05),最终选择1μM、10μM、100μM、1 m M和10 m M 5种药物浓度和48 h作用时间为后续实验条件;(2)单用促凋亡因子组(Fas L:1μg/ml、TNFα:1μg/ml、TRAIL:10 ng/ml)和促凋亡因子联合不同浓度二甲双胍组细胞活性均降低(P<0.05),同时联合组比单用促凋亡因子组细胞活性更低(P<0.05),并且这种差异会随着二甲双胍给药浓度的增加而逐渐变大;(3)促凋亡因子与10 m M二甲双胍联用组比单用促凋亡因子组、单用10 m M二甲双胍组细胞凋亡率进一步升高(P<0.05)、caspase-3活性进一步升高(P<0.05);(4)qPCR结果显示:用10 m M二甲双胍处理HepG2细胞48 h后,死亡受体和配体基因(m Fas、总Fas、Fas L、DR4、寻找更多DR5)、抑癌基因p53、线粒体通路相关基因Bax mRNA水平显著上升(P<0.05),caspase-8抑制蛋白基因FLIP、线粒体通路相关基因(Bcl-2、Bcl-x L)mRNA水平显著下降(P<0.05);(5)Western Blot结果显示Captisol:用1μM、10μM、100μM、1 m M和10 m M 5种不同浓度的二甲双胍处理HepG2细胞48 h后,在前四个药物浓度组中,Fas单体、Fas多聚体蛋白表达水平随二甲双胍药物浓度增加而逐渐上升,并在1 m M组中达到最高水平(P<0.05),但在10 m M二甲双胍组中Fas单体表达量较1 m M组未见显著上升,Fas多聚体则出现显著下降,降低至与control组无统计学差异;死亡受体蛋白(DR4、DR5)、转录因子p53、线粒体通路相关蛋白Bax表达水平逐渐升高,caspase-8抑制蛋白FLIP_L、线粒体通路相关蛋白(Bcl-2、Bcl-x L)、NF-κB通路上p Ser536-NF-κB p65表达水平逐渐降低。结论:二甲双胍一方面通过促进Fas、DR4、DR5、Bax等基因转录与蛋白表达,下调FLIP、Bcl-2、Bcl-x L等基因转录与蛋白表达,进而激活caspase-3诱导凋亡,这可能与二甲双胍上调p53 mRNA水平和蛋白表达水平有关。另一方面通过降低NF-κB p65在Ser536位点的磷酸化水平抑制细胞活性。最终促进死亡受体通路介导HepG2肝癌细胞株凋亡。