研究背景:创面愈合是人体中最复杂过程之一。当皮肤受到深度损伤后,表皮、真皮及皮下脂肪内多种类型细胞需要进行精确协调,以实现愈合。创面的止血、炎症、血管生成、生长、重新上皮化和重塑是按时间顺序发生的,但也是重叠的。巨噬细胞和成纤维细胞贯穿创面愈合始终,起举足轻重的作用。深II度烧伤创面在愈合过程中,由于持续性的炎症和异常的纤维化,极易导致瘢痕产生,无论对患者功能还是外观都产生深远影响。如何能在不影响深II度创面愈合情况下,早期应用药物减少瘢痕形成,目前研究尚少,缺少相关药物的治疗。二甲双胍(Metformin)一直是作为糖尿病治疗的首选药物。作为经典的腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)激活剂,近年来越来越多学者发现二甲双胍不仅能降低血糖,而且在抗肿瘤、抗炎、延缓衰老、抗纤维化等方面具有一定功效。由于二甲双胍已被证实具有抗炎、抑制纤维化作用,将其应用于深II度烧伤创面,能否调节创面微环境炎症及纤维化水平,进而改善创面愈合质量,减少瘢痕形成,目前尚未有类似研究。本课题旨在研究二甲双胍干预对深II度烧伤创面愈合的影响,初步阐明二甲双胍调控巨噬细胞和成纤维细胞在炎症和纤维化的分子机制,具有向临床应用快速转化的重大意义。因此,我们首先体内实验观察二甲双胍干预对大鼠深II度烧伤创面细胞外基质(ECM)主要成分:I型胶原(Collagen I)、III型胶原(Collagen III)、纤连蛋白(Fibronectin)及炎症因子与趋化因子表达量的影响,然后通过体外实验观察二甲双胍对巨噬细胞和成纤维细胞生物学行为的影响,进一步拟以NF-κB和AMPK/m TOR、TGF-β1/Smad3信号通路为主要线索探究其分子机制,最后将巨噬细胞、成纤维细胞共培养,体外模拟炎症微环境,探究二甲双胍在炎症微环境中的调控作用。通过本研究,从动物和细胞水平初步探究二甲双胍在改善深II度烧伤创面愈合质量的调节机制,并为其改善深II度烧伤创面愈合质量提供一种新的途径和思路。第一部分二甲双胍对大鼠深II度烧伤创面愈合的影响目的:探讨二甲双胍对大鼠深II度烧伤创面的I型胶原沉积、炎性因子与趋化因子的影响。方法:1、构建SD大鼠深II度烧伤模型6只。取自身做对照,烧伤后即刻在烧伤创面皮下注射不同浓度(1m M,10m M,100m M)二甲双胍1ml。实验分五组(阴性对照组(正常皮肤)、阳性对照组(Met0m M)、低剂量组(Met1m M)、中剂量组(Met10m M)、高剂量组(Met100m M))。造模成功后,立即注射二甲双胍,隔天注射持续一周,随后一周不继续干预,14d后提取烧伤创面组织。HE染色测量烧伤后创面真皮厚度,Masson染色观察创面Collagen I沉积。Western blot检测创面Collagen I表达情况。天狼星红染色及免疫组化检测Collagen III表达情况。免疫组化染色检测Fibronectin表达情况。2、根据方法1结果,取6只SD大鼠,实验分三组(阴性对照组(正常皮肤)、烧伤阳性对照组(PBS10m M)、实验组(Met100m M))。造模成功后,立即注射二甲双胍,隔天注射至第4天后取烧伤创面周缘0.5CM皮肤组织提取RNA,q RT-PCR检测相关炎性因子(IL1β)与趋化因子(CCL2)m RNA表达水平。结果:烧伤造模后大鼠全部存活,未出现烧伤创面坏死、溃疡、感染、延迟愈合等情况。HE结果显示:Met100m M组的真皮厚度较Met0m M组有明显降低,差异具有统计学意义(p<0.05),Met1m M组与Met10m M组真皮厚度与Met0m M组相比无统计学差异。Masson染色结果显示:Met100m M组I型胶原胶原容积分数(CVF)较Met0m M组有明显降低,差异具有统计学意义(p<0.05),Met1m M组与Met10m M组I型胶原胶原容积分数(CVF)与Met0m M组相比无统计学差异。Western blot检测结果提示:Met100m M组Collagen I表达量较Met0m M组明显下调,差异具有统计学意义(p<0.001)。天狼星红染色结果提示:Met100m M组、Met10m M组、Met1m M组Collagen III面积百分比均与Met0m M组相比无统计学差异(p>0.05)。免疫组化结果显示:Met100m M组、Met10m M组、Met1m M组Collagen III和Fibronectin相对吸光度均与Met0m M组相比无统计学差异(p>0.05)。q RT-PCR结果显示:Met100m M组的IL1β和CCL2 m RNA表达水平较PBS10m M组(烧伤阳性对照组)有明显下调(p<0.05)。结论:本实验成功构建大鼠皮肤深II度烧伤动物模型,通过隔日皮下注射100m M二甲双胍可抑制大鼠深II度烧伤创面的Collagen I沉积、炎性因子(IL1β)与趋化因子(CCL2)的表达。第二部分二甲双胍对RAW 264.7细胞生物学行为的影响目的:探讨二甲双胍对小鼠巨噬白血病细胞(RAW 264.7)增殖的影响;探讨二甲双胍是否抑制炎症因子和趋化因子的表达;探讨二甲双胍对LPS诱导的RAW264.7细胞凋亡的影响。方法:1、体外培养RAW 264.7细胞,利用CCK8细胞增殖实验验证二甲双胍对RAW264.7细胞增殖的影响;2、用不同浓度(2.5m M,5m M,10m M)二甲双胍干预RAW 264.7细胞24h,第18h加入1μg/L LPS,Western blot检测p NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表达水平,q RT-PCR检测IL1β和CCL2的m RNA表达水平,ELISA检测细胞培养上清CCL2表达水平;进一步采用10n M QNZ(NF-κB抑制剂)和不同浓度(2.5m M,5m M,10m M)二甲双胍同时干预RAW 264.7细胞24h,第18h加入1μg/L LPS,Western blot检测p NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表达水平,q RT-PCR检测IL1β和CCL2 m RNA表达水平;3、用不同浓度(2.5m M,5m M,10m M)二甲双胍干预RAW 264.7细胞24h,流式细胞术检测RAW 264.7凋亡细胞比例;用不同浓度(2.5m M,5m M,10m M)二甲双胍干预RAW 264.7细胞24h,第16h加入10μg/L LPS刺激,流式细胞术检测RAW 264.7凋亡细胞比例。结果:CCK8细胞增殖实验结果显示:不同浓度(0.5m M,1m M,5m M,10m M,20m M)二甲双胍干预RAW 264.7细胞24h,其增殖能力明显下调,并呈现剂量依赖性,差异具有统计学意义(p<0.05);Western blot结果显示:与对照组相比,Met2.5m M组、Met5m M组、Met10m M组p NF-κB p65蛋白表达水平明显下调(p<0.001),并呈现剂量依赖性,NF-κB蛋白表达水平无显著差异,而且q RT-PCR结果显示:Met2.5m M组、Met5m M组、Met10m M组IL1β、CCL2m RNA表达水平较对照组也出现明显下调,差异具有统计学意义(p<0.05);ELISA结果提示:Met2.5m M组、Met5m M组、Met10m M组细胞培养上清中CCL2蛋白表达量较对照组有明显下调(p<0.05),并呈现剂量依赖性;在加入NF-κB抑制剂(10n M QNZ)与二甲双胍同时干预RAW 264.7细胞后,Western blot结果显示QNZ干预后各组p NF-κB蛋白表达水平较阴性对照组明显下调(p<0.001)且QNZ干预后各组较阳性对照组p NF-κB、NF-κB蛋白表达水平无显著差异,各组NF-κB蛋白表达水平无明显差异,而且q RT-PCR结果显示:QNZ干预后各组IL1β、CCL2 m RNA表达水平与阳性对照组相比无显著差异(p>0.05);流式细胞术检测结果显示:不同浓度(2.5m M,5m M,10m M)二甲双胍干预RAW 264.7细胞24h,各组凋亡细胞比例无明显差异(p>0.05);不同浓度(2.5m M,5m M,10m M)二甲双胍干预RAW 264.7细胞24h,第16h加入10μg/L LPS刺激,Met2.5m M组、Met5m M组、Met10m M组凋亡细胞比例较对照组明显下调,差异具有统计学意义(p<0.001)。结论:二Roxadustat小鼠甲双胍可以抑制RAW 264.7细胞增殖,可能通过NF-κB途径抑制LPS诱导的炎性因子(IL1β)与趋化因子(CCL2)表达,并且能抑制高浓度LPS诱导下的RAW 264.7细胞凋亡。第三部分二甲双胍对NIH 3T3细胞生物学行为影响及其机制研究目的:观察二甲双胍通过激活AMPK对小鼠胚胎成纤维细胞(NIH 3T3)增殖、迁移和Collagen I表达的影响,以及探究其机制。方法:1、体外培养NIH 3T3细胞,利用CCK8细胞增殖实验验证二甲双胍对NIH3T3细胞增殖的影响;在NIH 3T3细胞株中转入AMPK-si RNA后,通过Western blot验证AMPK在NIH 3T3细胞中的干扰效率;行Ed U细胞增殖检测实验研究AMPK下调后对NIH 3T3细胞增殖的影响;2、用不同浓度(2.5m M,5m M,10m M)二甲双胍干预正常NIH 3T3细胞24h,行Transwell迁移实验,观察细胞迁移情况,Western blot检测pm TOR、m TOR、p AKT、AKT、MMP2、MMP9的表达;进一步在NIH 3T3细胞株中转入AMPK-si RNA后,行Transwell迁移实验,观察细胞迁移情况,Western blot检测pm TOR、m TOR、p AKT、AKT、MMP2、MMP9的表达;构建携带AMPK干扰序列的慢病毒,采用1/2小体积感染法转染和嘌呤霉素筛选AMPK下调稳转细胞株,通过Western blot验证AMPK在NIH 3T3细胞中的干扰效率;选择效率最高者,Western blot检测pm TOR、m TOR、p AKT、AKT、MMP2、MMP9的表达;3、用不同浓度(2.5m M,5m M,10m M)二甲双胍干预NIH 3T3细胞24h,Western blot检测TGF-β1、p Smad3、Smad3和Collagen I表达;在NIH 3T3细胞株中,转入AMPK-si RNA后,Western blot检测TGF-β1、p Smad3、Smad3和Collagen I表达;慢病毒构建稳定下调表达AMPK的NIH 3T3细胞株,Western blot检测TGF-β1、p Smad3、Smad3和Collagen I表达。结果:CCK8细胞增殖实验检测不同浓度二甲双胍对RAW26.7细胞增殖活性的影响,实验结果显示:不同浓度(0.1m M,0.5m M,1m M,5m M,10m M,20m M)二甲双胍干预NIH 3T3细胞24h,其增殖能力明显下调,并呈现剂量依赖性,差异具有统计学意义(p<0.05)。Ed U细胞增殖检测实验结果显示:NIH 3T3细胞株中转入AMPK-si RNA后,si AMPK组Ed U阳性细胞比例较si NC组明显上调,差异具有统计学意义(p<0.05);不同浓度(2.5m M,5m M,10m M)的二甲双胍干预NIH 3T3细胞24h后,与对照组相比,迁移细胞数量明显减少,并呈现剂量依赖性,差异具有统计学意义(p<0.001);不同浓度(2.5m M,5m M,10m M)的二甲双胍干预NIH 3T3细胞24h后,Western blot结果显示:与对照组相比,Met2.5m M组、Met5m M组、Met10m M组的pm TOR、p AKT、MMP2、MMP9蛋白表达水平明显下调(p<0.001),并呈现剂量依赖性,而m TOR、AKT蛋白表达水平无显著差异;在NIH 3T3细胞株中转入AMPK-si RNA后,Transwell迁移实验结果显示AMPK下调后NIH 3T3细胞迁移细胞数量较si NC组明显增多,差异具有统计学意义(p<0.001);在NIH 3T3细胞株中转入AMPK-si RNA后,Western blot结果显示与si NC组相比,pm TOR、p AKT、MMP2、MMP9蛋白表达水平明显上调(p<0.05),而m TOR、AKT蛋白表达水平无显著差异;慢病毒构建稳定下调表达AMPK的NIH 3T3细胞株,Western blot结果显示与sh NC组相比,pm TOR、p AKT、MMP2、MMP9蛋白表达水平明显上调(p<0.05),而m TOR、AKT蛋白表达水平无显著差异;不同浓度(2.5m M,5m M,10m M)的二甲双胍干预NIH 3T3细胞24h后,与对照组相比,Met2.5m M组、Met5m M组、Met10m M组的TGF-β1、p Smad3、Collagen I蛋白表达水平明显下调(p<0.05),并呈现剂量依赖性,而Smad3蛋白表达水平无显著差异;在NIH 3T3细胞株中转入AMPK-si RNA后,Western blot结果显示与si NC组相比,TGF-β1、p Smad3、Collagen I蛋白表达水平明显上调(p<0.01),而Smad3蛋白表达水平无显著差异;慢病毒构建稳定下调表达AMPK的NIH 3T3细胞株,Western blot结果显示与sh NC组相比,TGF-β1、p Smad3、Collagen I蛋白表达水平明显上调(p<0.01),而Smad3蛋白表达水平无显著差异。结论:二甲双胍可能通过激活AMPK抑制NIH 3T3细胞增殖、迁移及Collagen I合成,其中抑制NIH 3T3细胞迁移及Collagen I合成作用可能分别与二甲双胍激活AMPK从而下调m TOR及TGF-β1/Smad3通路有关。第四部分二甲双胍对炎症微环境中NIH 3T3和RAW 264.7细胞TGF-β1分泌的影响目的:构建体外细胞炎症微环境,研究二甲双胍对RAW 264.7/NIH 3T3细胞共培养体系中RAW 264.7和NIH 3T3细胞TGF-β1分泌的影响。方法:ELISA检测不同浓度(2.5m M,5m M,10m M)二甲双胍干预下RAW 264.7细胞培养上清液TGF-β1表达量;将NIH 3T3接种于Transwell下室,RAW 264.7细胞接种于Transwell上室,作为实验组,上下室同时加入或不加入1μg/ml LPS和Meselleck合成t(10m M),两种细胞共培养48h(NIH 3T3和NIH 3T3共培养作为对照组)。每组按LPS(1μg/ml)和Met(10m M)的干预措施不同分为3个亚组(LPS-Met-,LPS+Met-,LPS+Met+),总共6组。Western blot检测各组下室NIH 3T3细胞的Collagen I表达水平,ELISA检测各组Transwell小室内细胞培养上清中TGF-β1表达水平。结果:不同浓度(2.5m M,5m M,10m M)的二甲双胍干预RAW 264.7细胞后,加入1μg/L LPS刺激6h,ELISA结果显示:Met0m M组与对照组相比,TGF-β1表达量明显上调(p<0.05);与Met0m M组相比,Met2.5m M组、Met5m M组、Met10m M组的TGF-β1表达水平明显下调(p<0.001),并呈现剂量依赖性,差异具有统计学意义;提取共培养体系中的各组细胞培养上清,行ELISA检测TGF-β1水平,ELISA结果显示:在NIH 3T3/NIH 3T3组中,经过1μg/m L LPS刺激48h后,“LPS+Met-”组细胞培养上清中的TGF-β1表达量与“LPS-Met-”组相比明显下调(p<0.001),“LPS+Met+”组细胞培养上清中的TGF-β1表达量与“LPS+Met-”组相比也有明显下调(p<0.05);在RAW 264.7/NIH 3T3组中,“LPS+Met-”组细胞培养上清中的TGF-β1表达量较“LPS-Met-”组明显上调(p<0.001),“LPS+Met+”组细胞培养上清中的TGF-β1表达量与“LPS+Met-”组相比明显下调(p<0.001);在NIH 3T3/NIH 3T3组中,经过1μg/m L LPS刺激48h后,“LPS+Met-”组下室NIH 3T3细胞的Collagen I表达量与“LPS-Met-”组相比明显下调(p<0.001),“LPS+Met+”组下室NIH 3T3细胞的Collagen I的表达与“LPS+Met-”组相比明显下调(p<0.05);在RAW 264.7/NIH 3T3组中,经过1μg/m L LPS刺激48h后,“LPS+Met-”组下室NIH 3T3细胞Collagen I表达量较“LPS-Met-”组cellular structural biology明显上调(p<0.001),“LPS+Met+”组下室NIH 3T3细胞Collagen I表达量与“LPS+Met-”组相比明显下调(p<0.001),差异具有统计学意义。结论:二甲双胍在体外细胞炎症微环境中可能通过下调Transwell上室的RAW264.7细胞TGF-β1分泌,进而下调Transwell下室的NIH 3T3细胞Collagen I的表达。