研究目的:心室重塑是心脏受到损伤后的一种机体适应性反应,是损伤修复和心室整体代偿及继发的病理生理过程,包括心肌肥大,心肌细胞凋亡,心肌纤维化,炎症反应和血管重塑,最终导致左心室功能障碍,发展为终末阶段的心力衰竭。近年来,防治心室重塑的药物逐渐增多,但其发病率和死亡率仍居高不下。因此迫切需要寻找一种更加有效的预防和治疗方法。干细胞疗法已成为治疗多种疾病的研究热点,人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)是一种具有多系分化能力、高增殖能力、非致瘤性、抗炎特性和低免疫原性等独特优势的干细胞,已有研究表明间充质干细胞对心血管疾病(如心肌梗死,动脉粥样硬化)具有治疗作用,那么,hAMSCs对心室重塑是否具有延缓其发展或治疗作用?本课题对hAMSCs在小鼠心室Patrinia scabiosaefolia重塑发生发展过程中的作用及其可能机制进行了探究,旨在为临床心室重塑患者的细胞治疗提供可行的理论和实验依据。实验方法:1.hAMSCs的分离、培养和鉴定:1)通过酶消化法分离得到hAMSCs,常规培养至P3代进行细胞鉴定;2)流式细胞术检测hAMSCs相关表面抗原;3)细胞免疫荧光检测hAMSCs是否表达胚胎干细胞标志物;4)体外成骨分化诱导实验检测hAMSCs多向分化的能力;5)重度免疫缺陷小鼠(M-NSG)体内移植细胞实验和软琼脂集落形成实验检测hAMSCs在体内外的致瘤性。2.hAMSCs移植对小鼠心室重塑的作用:1)心室重塑模型的制备:采用每天皮下注射40mg/kg异丙肾上腺素(Isoproterenol,ISO)构建小鼠心室重塑模型;2)hAMSCs的移植:注射ISO 7天后,尾静脉移植hAMSCs进入心室重塑小鼠体内(细胞数:8×10~5cells/只),每7天移植1次,共移植3次;3)小鼠心脏形态和功能检测:小动物超声心动仪检测各组小鼠(生理盐水组,ISO组,ISO+hAMSCs组)造模前后心功能变化;收取心脏组织样本,测量心脏体重比,血液细胞分析仪测量血常规;4)心脏组织学检测:心脏组织进行HE和马森染色检测心肌组织结构变化及纤维化程度;5)心肌损伤和纤维化相关指标检测:Western blot和RT-q PCR实验检测ANP、BNP和collagenⅢ等;6)心脏组织血管密度检测:利用免疫组织化学观察心脏组织中血管数量的变化;7)hAMSCs的迁移:尾静脉移植羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的hAMSCs进入心室重塑小鼠体内,荧光显微镜观察移植hAMSCs 1天和3天后在心脏组织中的定植能力;心脏组织石蜡切片进行CD90和MAB1281双重免疫荧光检测hAMSCs是否转分化为其他功能受损的细胞。3.hAMSCs对巨噬细胞的影响:1)巨噬细胞浸润检测:组织免疫荧光检测心脏组织中CD206的表达水平;2)巨噬细胞极化检测:通过Western blot和RT-q PCR检测心脏组织中CD206,CD86,IL-10的蛋白和m RNA表达水平;3)离体实验RAW264.7巨噬细胞极化检测:在体外实验中,通过ISO诱导RAW264.7巨噬细胞向M1型极化,再将hAMSCs-CM与RAW264.7共孵育,Western blot检测细胞中i NOS,Arg-1的表达水平。4.巨噬细胞分泌因子对hAMSCs旁分泌的影响:1)hAMSCs抗炎基因检测:实验分为ISO+RAW264.7上清诱导的hAMSCs和未经过诱导的hAMSCs两组,收集两组细胞RNA及条件性培养基(CM),RT-q PCR实验检测hAMSCs表达IDO,IL-10和COX-2的水平;2)体外共孵育体系构建:条件性培养基与3T3成纤维细胞共孵育,检测hAMSCs分泌物对3T3细胞活化的影响,实验分为3T3对照组;ISO+RAW→3T3模型组,ISO+RAW→3T3+hAMSCs-CM治疗1组,ISO+RAW→3T3+hAMSCs-CM←ISO+RAW治疗2组;3)成纤维细胞激活检测:RT-q PCR实验检测各组αSMA和COLⅢ的表达情况。实验结果:1.hAMSCs的鉴定:1)经酶消化法成功分离了hAMSCs,其形态呈典型的成纤维状;2)流式细胞术检测结果表明hAMSCs高表达间充质干细胞标志物:CD90,CD73,CD44,不表达造血干细胞标志物和低表达组织相容性Ⅰ类抗原:CD34,CD45及HLA-ABC;3)细胞免疫荧光检测发现hAMSCs表达胚胎干细胞标志物:OCT-4,SSEA-4;4)成骨分化实验结果表明hAMSCs在体外可诱导分化为骨细胞;5)体内外致瘤实验结果表明hAMSCs在体内外均无致瘤性。2.hAMSCs移植减缓小鼠心室重塑的作用,有助于维持心功能:1)皮下注射ISO诱导小鼠发生心肌肥厚,心肌纤维化,及心功能下降,表明成功构建了小鼠心室重塑模型;2)超声心动图分析表明hAMSCs可减轻心室扩张,增强心功能;hAMSCs移植可降低小鼠的心脏体重比和血液中白细胞、中性粒细胞的数量;3)HE和马森染色结果表明,hAMSCs移植改善小鼠心肌组织排列紊乱,降低纤维化程度;4)Western blot和RT-q PCR检测结果发现,hAMSCs降低心室重塑组织中ANP,BNP和COLⅢ的表达水平;5)组织免疫组化检测表明hAMSCs移植后心脏组织中CD31阳性率增加,即血管数量增多;6)组织免疫荧光检测显示hAMSCs会少量定值于心室重塑小鼠心脏中,并且hAMSCs定值于心脏中并未转分化为其他受损的细胞。3.hAMSCs及其分泌物(hAMSCs-CM)促进巨噬细胞转化为M2型:1)组织免疫荧光检测发现hAMSCs增加心脏组织中CD206的表达水平,表明促进向M2型巨噬细胞极化;2)hAMSCs移植后减少小鼠心脏组织中CD86表达水平,增加CD206和IL-10的表达水平;3)在离体实验中,hAMSCs-CM与RAW264.7共孵育后降低了i NOS的表达,但增加了Arg-1的表达水平。4.巨噬细胞分泌因子增强hAMSCs的旁分泌作用,抑制成纤维细胞活化:1)经过ISO+RAW264.7细胞上清诱导的hAMSCs较未经诱导的hAMSCs表达更高水平的抗炎基因IDO,IL-10和COX2;2)并且经过IGSKJ4浓度SOAdezmapimod体内实验剂量+RAW264.7细胞上清诱导的hAMSCs-CM与3T3细胞共孵育后,3T3细胞表达αSMA和COLⅢ的量较未经诱导的hAMSCs-CM组更低,表明巨噬细胞分泌因子明显增加hAMSCs的旁分泌作用进而抑制成纤维细胞活化。结论:移植hAMSCs可减轻ISO诱导小鼠的心肌肥大、心脏纤维化,改善心功能、增加血管数量从而延缓心室重塑的发生发展,其机制可能与hAMSCs通过旁分泌发挥保护小鼠心室重塑的作用有关,增加了巨噬细胞向M2型极化,发挥抗炎作用,并且巨噬细胞分泌的细胞因子进一步增强了hAMSCs的旁分泌作用。