目的:利用体内外实验探究人脐带间充质干细胞来源的外泌体(human umbilical cord mesenchymal stem cells derived exosomes,huc MSC-Ex)对糖尿病肾病(Diabetic Kidney Diseases,DKD)的治疗效果,基于单细胞测序(Single-cell RNA sequencing,sc RNA-seq)探究其细胞、分子差异表达以及相关信号通路表达,深入了解huc MSC-Ex与DKD发病机理的关系。方法:外泌体的提取、鉴定及浓度检测:采用脐带组织块贴壁的方法,分离人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells,huc MSCs),采用超速离心法提取huc MSCs培养皿上清中的外泌体;蛋白印迹法检测hucMSC-Ex表面阳性标志物例如CD63、CD81;应用透射电子显微镜观察huc MSC-Ex的形态,纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)观察所提取外泌体的粒径大小;利用体内实验验证人脐带间充质干细胞来源的外泌体(human umbilical cord mesenchymalWnt-C59配制 stem cell-derived exosome,huc MSC-Ex)改善DKD小鼠:本实验采用自发性糖尿病小鼠db/db鼠作为实验组,采用db/m鼠作为正常对照组(Negative Control,NC),实验组采用高脂高糖喂养,NC组采用普通饲料喂养,连续喂养10周,每周监测空腹血糖(Fasting Blood Glucose,FBG),定期收集尿液标本检测尿白蛋白排泄率,当db/db小鼠FBG值持续≥16.7mmol/L,24小时尿白蛋白排泄率明显大于NC组,实验组小鼠精神较NC组萎靡,毛发较对照组稀疏、毛糙,饮水、吃食及排泄量多于NC组时,可视为DKD造模成功,随机将上述小鼠分为DKD组(7只)及DKD+huc MSC-Ex组(7只),随机选取7只db/m鼠记为NC组,DKD+huc MSC-Ex组尾静脉注射huc MSC-Ex(10mg/kg),DKD组及NC组尾静脉注射同等剂量的PBS,连续8周(3次/周),每两周检测一次FBG、体重(Body Weight,BW),8周后处死小鼠,使用尿蛋白定量试剂盒检测小鼠的24h尿蛋白排泄率,酶联免疫吸附实验试剂盒检测小鼠血肌酐(Serum creati-nine,Scr)、尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN)等生化指标,一侧肾脏利用苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin,HE)染色评估肾脏组织病变程度,免疫组化评估肾脏细胞的增殖情况,另一侧肾脏解离上机行单细胞转录组测序,免疫荧光评估相关免疫细胞在肾脏组织中的表达。利用sc RNA-seq探究huc MSC-Ex治疗前后肾脏细胞的数量变化及潜在的分子作用通路:取上述DKD组及DKD+huc MSC-Ex组的小鼠解离肾脏组织制备单细胞悬液上机进行sc RNA-seq,利用聚类降维法、小提琴图、基因热图等生信组学分析huc MSC-Ex治疗前后肾脏固有细胞群落变化,结合肾脏转录组芯片结果,利用细胞群落间的信息通讯化和差异基因富集分析进行分析,借助ligand-receptor数据库分析细胞间通讯关系从而探究huc MSC-Ex治疗前后相关肾脏存在的固有细胞间的比例变化,推测出其可能存在的作用关系及相关信号传导通路;体外实验验证huc MSC-Ex活化巨噬细胞是改善糖尿病肾病的关键:体外培养RAW264.7细胞,待培养状态良好时将huc MSC-Ex加入培养皿中,将上述细胞分为RAW组及RAW+huc MSC-Ex组,行CCK8实验验证细胞增殖活力,行transwell实验验证细胞侵袭能力,流式细胞仪检测RAW+huc MSC-Ex组与II型巨噬细胞细胞(M2-type macrophages,M2)标志物(F4/80+CD206+)的表达;利用sc RNA-s-eq分析出huc MSC-Ex作用前后肾脏固有细胞的占比及其可能存在的信号传导通路,建立巨噬细胞和高糖下的近端肾小管上皮细胞(Proxi-mal renal tubular epithelial cells,PT)共培养体系,72小时后重复上述CCK8实验及细胞迁移实验,利用定量实时聚合酶链反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,QRT-PCR)验证M2与高糖条件诱导下的PT间可能存在的交互通路。结果:透射电子显微镜下观察hucMSC-Ex为盘状的囊泡,蛋白印迹法表明huc MSC-Ex表达特异性CD81及CD63蛋白分子;采用NTA追踪分析发现外泌体微粒直径集中在100-200nm之间;确认细节与NC组相比,DKD组的小鼠FBG、BW及24h尿白蛋白排泄率均明显升高,经过8周的治疗,与DKD组小鼠相比,DKD+huc MSC-Ex组小鼠血糖较前下降体重(P<0.05)、24h尿白蛋白排泄率下降(P<0.05),Scr较前下降,且具有统计学意义(P<0.05),BW及BUN较DKD组有所下降,但无统计学意义(P>0.05);肾脏病理学显示与NC组相比,DKD组HE染色病理组织可以明显看到毛细血管球体积显著增大,系膜区扩张,细胞外基质沉积增多,肾小管空泡样变形,DKD+hucMSC-Ex组与NC组相比肾小球体积虽无法逆转到正常状态,但对比DKD组系膜区扩张改善,细胞外基质沉积减少,肾小管空泡变性减少;免疫组化显示与NC组相比,DKD组Ki67的阳性率较前明显减少,说明肾脏细胞增殖降低,与DKD组相比,DKD+huc MSC-Ex组Ki67的阳性表达较前增加,说明经过外泌体治疗后,肾脏细胞的增殖较前增加;Sc RNA-seq分析肾脏细胞发现经过huc MSC-Ex治疗后共有10组细胞群落存在差异,其中M2、PT细胞占比较前增加,肾脏免疫荧光结果提示经huc MSC-Ex治疗后M2细胞表面标志物(F4/80+CD206+)较DKD组以及NC组增多,说明huc MSC-Ex是通过促进M2细胞的活化改善DKD;体外培养RAW264.7巨噬细胞,分为RAW组及RAW+huc MSC-Ex组,CCK8实验显示RAW+huc MSC-Ex组细胞的Biotic resistance活力高于RAW组(P<0.01),且10^8/ml浓度的huc MSC-Ex最佳,transwell实验显示RAW+huc MSC-Ex组迁移侵袭能力显著高于RAW组(P<0.001);取上述两组细胞,待状态良好时行流式细胞学结果表明加入huc MSC-Ex后M2细胞表面标志物(F4/80+CD206+)较DKD组增加,且具有统计学意义(P<0.05),说明huc MSC-Ex可作用于M2细胞,结合上述体内免疫荧光实验结果,更充分说明huc-MSC-Ex通过活化M2细胞改善DKD;体外培养TCMK-1细胞,待生长状态良好时进行分组分为TCMK-1+RAW组、TCMK-1+培基组、TCMK-1+huc MS-C-Ex组及TCMK-1+RAW+huc MSC-Ex组,将加入huc MSC-Ex的RAW264.7细胞与高糖诱导的TCMK-1细胞建立共培养体系后再次行CCK8实验,与其他组相比,TCMK1+RAW+huc MS C-Ex组细胞增殖增加,自第48h起,随着时间的延长,其细胞的增殖活力增加(P<0.05);行transwell实验表明与其他组相比,TCMK-1+RAW+huc-MSC-Ex组细胞迁移增加,且具有统计学意义(P<0.001);利用sc RNA-seq检测分子在巨噬细胞中的表达量,结果表明Cd74在巨噬细胞中表达增加,前期的实验结果表明huc MSC-Ex可通过活化M2细胞作用于PT细胞,我们绘制所有huc MSC-Ex刺激后的M2与PT细胞间的信号传导通路交互图(Cirle图),结果表明APP信号传导通路参与到上述过程中,故推测APP/Cd74信号通路可能是huc MSC-Ex通过激活巨噬细胞作用于PT细胞延缓DKD的关键通路,利用sc RNA-seq分析绘制cell type dot图,结果表明APP/Cd74信号通路在M2细胞对PT细胞作用中表达较强,利用体外q RT-PCR实验结果表明DKD+huc MSC-Ex组APP/Cd74信号通路表达较DKD组明显增强(P<0.001)。结论:体内实验验证hucMSC-Ex是保护肾功能延缓DKD进程的关键成分;单细胞测序技术及体内外实验验证M2细胞与PT细胞交互改善糖尿病肾病进程;huc MSC-Ex可能通过APP/Cd74信号通路参与到活化M2细胞作用于PT细胞改善糖尿病肾病进程中。