研究目的:探讨类风湿性关节炎(RA)患者外周血低密度粒细胞(LDGs)对结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)检测中分泌γ干扰素(IFN-γ)的T淋巴细胞的影响及其相关机制。研究方法:1.采集RA患者及健康人外周全血,通过密度梯度离心分离并收集单个核细胞(PBMCs)层细胞,采用流式细胞术检测两组PBMCs中LDGs所占比例。2.对2020年5月至2021年7月期间于南昌大学第一附属医院接受T-SPOT.TB检测的所有受试者进行回顾性分析,对比其中RA患者T-SPOT.TB检测结果阳性率与总体阳性率的差异。3.选择近期接受过T-SPOT.TB检测,且其任一检测孔中斑点数≥1的RA患者,采集外周血并分离PBMCs层细胞,通过流式细胞术检测其中LDGs的比例,将PBMCs分为LDGs低比例组(LDG≤5%)和LDGs高比例组(LDG>5%),并分别进行T-SPOT.TB检测,比较两组患者T-SPOT.TB检测结果的差异,探究LDGs的比例与T-SPOT.TB检测结果的相关性。4.选择近期接受过T-SPOT.TB检测,且其任一检测孔中斑点数≥1的RA患者,采集外周血并分离PBMCs层细胞,首先进行LDGs比例检测,根据其中LDGs的比例进行分别处理:(1)LDGs较高比例(LDGs>5%)者,将PBMCs分为两组:(1)LDGs去除组,采用免疫磁珠正选法去除其中的LDGs;(2)对照组,不进行其他处理。(2)LDGs较低比例(LDGs≤5%)者,将PBMCs分为两组:(1)LDGs外源加入组:在PBMCs中加入纯化的LDGs;(2)对照组,不进行其他处理。一方面,取各组细胞同时进行T-SPOT.TB检测,分析去除或外源增加LDGs对T-SPOT.TB检测的影响。另一方面,在去除LDGs前后的PBMCs中加入植物凝集素(PHA)进行细胞刺激,再采用流式细胞术检测各组细胞中T淋巴细胞内IFN-γ的水平,探究LDGs对T淋巴细胞分泌IFN-γ的影响。5.采集RA患者及健康人外周全血,通过密度梯度离心获取RA患者的PBMCs、其自身正常密度中性粒细胞(NDGs)以及健康人NDGs,通过流式细胞术检测RA-LDG和RA-NDG中CD14~-CD15~+LOX-1~+细胞的比例,探讨其中多形核髓源性抑制细胞(PMN-MDSCs)的比例。同时检测RA-LDG、RA-NDG和HC-NDG表面负性共刺激分子CD155、T细胞活化V结构域Ig抑制剂(VISTA)及程序性死亡配体1(PD-L1)的表达水平。6.收集RA患者外周血并分离PBMCs,选择其中LDGs较高比例(LDGs>5%)的PBMCs并分为三组:(1)对照组,不进行其他处理;(2)去除组,采用免疫磁珠正选法去除PBMCs中的LDGs;(3)PD-L1阻断组,PBMCs以抗PD-L1单克隆抗体进行功能阻断。三组同时进行T-SPOT.TB检测,探究在PBMCs中进行PD-L1阻断对T-SPOT.TB检测结果Medical implications的影响。7.收集RA患者外周血并分离PBMCs,选择其中LDGs较低比例(LDGs≤5%)的PBMCs并分为三组:(1)对照组,不进行其他处理;(2)LDG加入组,在PBMCs中加入未处理的纯化LDGs;(3)PD-L1阻断的LDG加入组,纯化的LDGs以抗PD-L1单克隆抗体处理1h,再洗去游离的抗体后加入PBMCs中。三组同时进行T-SPOT.TB检测,探究LDGs表面PD-L1的表达对T-SPOT.TB检测结果的影响。8.收集RA患者外周血并分离PBMCs,选择其中LDGs较高比例(LDGs>5%)的PBMCs,将其分为两组:(1)去除组,采用免疫磁珠正选法去除其中的LDGs;(2)对照组,不进行其他处理。将两组细胞按T-SPOT.TB检测方法在培养孔中加入结核分枝杆菌的特异性抗原进行刺激并培养18-20h,收集培养上清液并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测其中精氨酸酶1(Arg-1)和转化生长因子β(TGF-β)的水平,并在此基础上分析LDGs比例与培养上清中Arg-1和水TGF-β水平的相关性。研究结果:1.RA患者LDGs占PBMCs比例显著高于健康对照组(9.795±4.893 vs0.760±0.617,P<0.0001)。2.RA患者T-SPOT.TB检测阳性率显著低于T-SPOT.TB检测的总体阳性率(29.79%vs 43.28%,P<0.0001)。3.在接受T-SPOT.TB检测且任一检测孔中斑点数≥1的RA患者中,LDGs高比例组的T-SPOT.TB阳性率显著低于LDG低比例组(33.33%vs 48.61%,P=0.0842)。4.在高LDG比例且T-SPOT.TB检测的任一检测孔斑点数≥1的RA患者中,去除LDGs后PBMCs中产生IFN-γ的T淋巴细胞的比例显著升高(0.951±0.476 vs2.113±1.040,P=0.0017),胞内IFN-γ的平均荧光强度(Mean fluorescence intensity,MFI)也显著升高(597.2±280.4 vs 670.0±323.8,P=0.0040)。同时,去除RA患者PBMCs中的LDGs后,ESAT-6抗原刺激孔斑点数(9.190±21.87 vs 21.43±31.70,P=0.0005),CFP-10刺激孔斑点数(2.643±4.951 vs 10.52±12.61,P<0.0001)以及ESAT-6和CFP-10刺激孔斑点数之和(11.83±23.01 vs 31.95±40.61,P<0.0001)均显著增多,T-SPOT.TB检测的阳性率也显著升高(38.10%vs 85.71%,P<0.0001)。5.在低LDG比例且T-SPOT.TB检测的任一检测孔斑点数≥1的RA患者中,在其PBMCs中外源性加入LDGs后,ESAT-6刺激孔斑点数(19.40±28.88 vs10.10±20.09,P=0.0017),CFP-10刺激孔斑点数(14.10±43.84 vs 10.25±37.86,P=0.0409)以及ESAT-6和CFP-10刺激孔的斑点数之和(33.50±59.24 vs20.35±49.71,P=0.0004)均显著减少,同时T-SPOT.TB的检测阳性率由65.00%降低至40.00%(P=0.2049)。6.与RA-NDGs比较,RA-LDGs高表达LOX-1(63.38±10.95 vs 27.00±11.51,P<0.0001),提示其主要为多形核髓源性抑制细胞(PMN-MDSCs)。同时,RA-LDGs表面PD-L1的表达显著高于RA-NDGs(32.72±20.53 vs 5.757±5.085,P<0.0001)以及HC-NDGs(32.72±20.53 vs 11.70±4.658,P<0.0001)。CD155和VISTA在RA-LDGs、RA-NDGs及HC-NDGs上的表达没有显著差异。7.与未处理对照组比较,阻断PBMCs细胞的PD-L1信号后再进行T-SPOT.TB检测时,ESAT-6刺激孔斑点数(3.118±4.337 vs 8.647±8.526,P=0.0017),CFP-10刺激孔斑点数(2.000±3.325 vs 4.529±5.304,P=0.0087)以及ESAT-6和CFP-10刺激孔斑点数之和(5.118±6.397 vs 13.18±10.92,P=0.0002)均显著增多;而与去除LDGs相比,PD-L1功能阻断后的ESAT-6刺激孔斑点数(15.29±17.75 vs 8.647±8.526,P=0.0527),CFP-10刺激孔斑点数(9.706±8.770vs 4.529±5.304,P=0.0050)以及ESAT-6和CFP-10刺激孔斑点数之和(25.00±23.63vs 13.18±10.92,P=0.0155)仍然显著减少。8.与加入未处理LDGs的PBMCs比较,采用加入阻断PD-L1的LDGs后的PBMCs进行T-SPOT.TB检测时,ESAT-6刺激孔斑点数(5.643±12.06 vs8.500±15.70,P=0.2262),CFP-10刺激孔斑点数(13.93±44.58 vs 15.00±45.58,P=0.1358)以及ESAT-6和CFP-10刺激孔斑点数之和(19.57±55.79 vs 23.50±57.97,P=0.1094)均有所增加;而与未处理对照组相比,在PBMCs中加入阻断PD-L1的LDGhttps://www.selleck.cn/products/ABT-263.htmls后,ESAT-6刺激孔斑点数(10.71±17.06 vs 8.500±15.70,P=0.0396),CFP-10刺激孔斑点数(19.07±51.58 vs 15.00±45.58,P=0.1821)以及ESAT-6和CFP-10刺激孔斑点数之和(29.79±65.29 vs 23.50±57.97,P=0.0694)仍然有所减少。9.与未处理对照组比较,去除PBMCs中的LDGs后,ESAT-6刺激孔(452.4±442.8 vs 273.6±261.6,P=0.0315)和CFP-10刺激孔(599.1±443.5 vs495.Cobimetinib0±490.2,P=0.0151)中Arg-1的水平显著降低,ESAT-6刺激孔(66.77±49.53vs 16.35±6.726,P=0.0042)和CFP-10刺激孔(61.79±33.98 vs 16.02±6.273,P=0.0005)中TGF-β的水平也显著降低,同时对应孔中斑点数均有所增加。进一步研究显示,PBMCs中LDGs的比例与培养上清液中Arg-1和TGF-β的浓度均呈正相关。结论:1.类风湿关节炎患者外周血中LDGs水平显著升高,且可抑制T淋巴细胞分泌IFN-γ的功能进而降低T-SPOT.TB检测的阳性率。2.类风湿关节炎患者外周血中LDGs具有PMN-MDSCs的表型,同时高表达PD-L1,其抑制T细胞分泌IFN-γ的功能部分是通过表面高表达的PD-L1介导的。3.类风湿关节炎患者外周血中LDGs高表达Arg-1和TGF-β,这两种免疫抑制分子可能与LDGs抑制T细胞活化的功能相关。