研究背景深低温停循环(deep hypothermic circulatory arrest,DHCA)被广泛用于成人主动脉弓部手术和婴幼儿复杂先心病手术。然而,DHCA心血管手术中的低温缺血再灌Navitoclax浓度注(ischemia-reperfusion,I/R)环境是导致术后急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)的主要原因之一,且目前仍缺乏针对AKI的有效预防和治疗措施。研究表明,冷诱导RNA结合蛋白(cold-inducible RNA-binding protein,CIRP)在低氧和低温应激条件下被诱导表达增加,可对多个器官具有保护作用。本研究旨在探讨CIRP在深低温I/R过程中是否具有肾脏保护作用及其可能的机制。研究方法利用成年雄性野生型和Cirp基因敲除(Cirp-/-)大鼠建立模拟临床的DHCA心脏手术模型。将大鼠分为假手术组(Sham组)、DHCA组和DHCA+Cirp-/-组,每组5只。通过对肾脏取材进行RNA转录组和蛋白质组测序分析,比较野生型与Cirp-/-大鼠在DHCA后肾细胞基因和蛋白表达的差异,并筛选可能涉及的生物学功能和分子通路。采用多种生物化学和分子生物学技术,检测并比较各组的围术期生理指标、血气指标、术后肾功能指标、AKI特异性标志物水平、肾脏病理表型、肾细胞超微结构改变、肾细胞凋亡程度、血清炎症因子、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、相关mRNA和蛋白表达情况等。研究结果本研究发现DHCA可显著诱导大鼠肾脏CIRP的表达(P<0.05),并促使CIRP从细胞核转移至细胞质。在DHCA术后,与野生型相比,Cirp-/-大鼠肾脏缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的关键调控因子脯氨酸羟化酶3(prolyl hydroxylase 3,PHD3)的表达显著升高,从而抑制了 HIF-1α的表达(P<0.05)。此外,Cirp基因缺失引起肾组织ROS积聚增加,转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)/p38 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)炎症通路显著激活(P<0.05),血清炎症因子水平升高和线粒体损伤加剧(P<0.05),线粒体细胞色素C向胞浆释放增加(P<0.05),线粒体途径凋亡通路细胞色素C-凋亡蛋白酶激活因子1(apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1)-半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)9、死亡配体途径凋亡通路Fas相关死亡结构域蛋白(Fas-associated death domain protein,FADD)-Caspase 8、两通路的共同靶点 Caspase 3 以及促凋亡的 Bcl-2 关联 X 蛋白(Bcl-2-associated x protein,Bax)、凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF)的表达皆显著升高(P<0.05),而抗凋亡因子Bcl-2表达显著降低(P<0.05),引发DHCA术后肾细胞过度凋亡,从而显著加重肾细胞结构和功能损伤。研究结论第一部分的研究结果表明,在DHCA术中,CIRP可通过抑制PHD3调节HABT-199纯度IF-1α的表达。同时,CIRP可通过抑制炎症反应和细胞凋亡减轻深低温心脏手术中肾脏I/R损伤,从而对肾功能起到保护作用。研究背景在低氧、低温的刺激下,CIRP可在多种器官表达增加,以帮助机体适应不良环境。来自本中心的研究发现,大鼠的心脏和脑组织在低温体外循环心脏手术中可分泌CIRP以减轻I/R损伤。本研究的第一部分证明了大鼠肾脏也可通过分泌CIRP及其对下游分子的调节抵抗DHCA环境中氧化应激性炎症和凋亡的发生。然而,CIRP在人肾细胞中是否与在大鼠肾脏中具有相似的表达特征及作用机制尚不得而知,且CIRP对PHD3/HIF-1α轴的影响及TGF-β1/p38 MAPK炎症通路激活的因果关系尚未被探明。因此,我们将在本部分中对这些问题进行探讨。研究方法利用人肾小管上皮细胞HK-2细胞系建立深低温氧糖剥夺/复氧复糖(hypothermic oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,hOGD/R)模型,具体方法为18℃ 1%O2无糖条件干预细胞6h,随后37℃ 21%O2复糖培养30min。通过小干扰RNA转染手段,分别构建CIRP或PHD3基因敲低的HK-2细胞,siNC为阴性对照。细胞分组为:Control 组、hOGD/R 组、hOGD/R+siNC 组、hOGD/R+siCIRP组和hOGD/R+siPHD3组,每组3个重复。检测并比较各组细胞CIRP/PHD3/HIF-1 α轴、炎症和凋亡通路蛋白的表达情况、ROS水平、炎症因子水平、细胞活力和凋亡程度、线粒体膜电位、能量代谢水平等。研究结果经过hOGD/R干预后,HK-2细胞内CIRP的表达显著增加(P<0.05),并从细胞核转移至细胞质中。同时,HK-2细胞活力下降,发生显著的凋亡(P<0.05)。利用siRNA敲低CIRP基因后,PHD3的表达显著增加(P<0.05),引发HIF-1α大量降解。然而,当PHD3基因被敲低时,HK-2细胞内HIF-1α得到稳定表达,细胞在hOGD/R条件下的凋亡程度得到显著genetic connectivity缓解(P<0.05)。siNC的干预对细胞的活力和CIRP的表达无显著影响(P>0.05)。在hOGD/R环境中,与未转染的HK-2细胞相比,CIRP基因敲低通过PHD3间接抑制了 HIF-1α的表达,引起硫氧还蛋白1(thioredoxin 1,Trx-1)和复制蛋白 A2(replication protein A2,RPA2)的表达受限,分别造成细胞内ROS和受损DNA的蓄积显著增多(P<0.05)。而通过敲低PHD3基因解除对HIF-1α的抑制后,HK-2细胞内Trx-1和RPA2表达显著增加,ROS蓄积的情况较野生型细胞明显缓解(P<0.05)。此外,与大鼠肾脏内的结果相似,与单纯低温I/R干预相比,额外给予CIRP基因抑制造成的HIF-1α的降解引发TGF-β1/p38 MAPK炎症通路的显著激活和炎症因子生成增多(P<0.05),线粒体膜电位降低、ATP生成减少、线粒体外细胞色素C释放增加(P<0.05),线粒体凋亡通路关键蛋白Apaf-1、Caspase 9的表达显著增加(P<0.05),同时死亡配体途径关键靶点FADD、Caspase 8以及两通路的共同靶点Caspase 3的表达水平都显著升高(P<0.05)。相反,通过siPHD3干预稳定了 HIF-1α的表达后,上述炎症和凋亡通路靶点被显著抑制(P<0.05),ATP生成情况显著改善,凋亡细胞百分比明显降低(P<0.05)。研究结论以上结果表明,在深低温I/R的条件下,肾细胞可通过分泌CIRP调节PHD3/HIF-1α轴的表达,促进ROS的清除和受损DNA的修复,减轻氧化应激性炎症反应,抑制细胞凋亡通路的激活,从而避免细胞过度凋亡,维持肾细胞能量代谢,以帮助机体适应低温低氧刺激。上述机制在人和大鼠肾细胞中同样存在。研究背景HIF-1α是细胞抗缺氧防御机制的主要调节因子,可广泛参与I/R损伤的代谢、促红细胞生成、抗炎、抗凋亡等病理生理过程,常氧下其活性受PHD羟基化降解的直接调控。靶向抑制HIF-1α羟化酶的药物已被用于多种缺氧性疾病和慢性肾病贫血的治疗。其中,新型口服PHD特异性抑制剂enarodustat(JTZ-951)被发现在多种肾脏损伤动物模型中对肾脏具有保护作用。本部分研究旨在前两部分研究的基础上,利用大鼠DHCA模型和HK-2细胞hOGD/R模型,探究外源性给予enarodustat对肾脏深低温I/R的影响。研究方法给予siCIRP或siNC阴性对照转染的HK-2细胞以enarodustat或二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶剂对照干预后,按第二部分的研究方案建立细胞 hOGD/R 模型,将细胞分为 hOGD/R 组、hOGD/R+siCIRP 组、hOGD/R+enarodustat组和 hOGD/R+siCIRP+enarodustat 组,检测并比较各组细胞 CIRP/PHD3/HIF-1α 轴、凋亡通路蛋白的表达和细胞凋亡情况。术前连续5天给予enarodustat或溶剂对照灌胃后,利用成年雄性野生型和Cirp-/-大鼠建立模拟临床的DHCA心脏手术模型,将大鼠分为DHCA组、DHCA+Cirp--组和DHCA+Cirp-/-+enarodustat组。检测并比较各组大鼠CIRP/PHD3/HIF-1α轴、凋亡通路蛋白表达、肾脏病理表型和肾功能指标。研究结果Enarodustat预处理对细胞CIRP的表达无显著影响。与单纯hOGD/R相比,经过hOGD/R+enarodustat干预后,HK-2细胞的PHD3蛋白的表达被显著抑制(P<0.05),而HIF-1α蛋白表达显著增加(P<0.05),Bax的表达显著减少(P<0.05),Bcl-2 的表达显著增加(P<0.05),Caspase 9、FADD、Caspase 8 和 Caspase 3 的激活被显著抑制(P<0.05),流式细胞术分析细胞凋亡百分比显著减少(P<0.05)。给予enarodustat 后,siCIRP 诱导的 Bax、Caspase 9、FADD、Caspase 8 和 Caspase 3 上调和细胞凋亡增加的趋势被显著抑制(P<0.05),enarodustat干预通过抑制PHD3和稳定HIF-1α的表达,部分逆转了CIRP沉默所加剧的hOGD/R后HK-2细胞凋亡的趋势(P<0.05)。与细胞实验结果相似,给予大鼠enarodustat灌胃后,大鼠肾组织PHD3表达被抑制,HIF-1α的表达显著增加,Cirp-/-加剧的DHCA后肾组织病理损伤的趋势被显著缓解(P<0.05),DHCA+Cirp-/-+enarodustat组肾组织损伤评分显著低于DHCA+Cirp-/-组(P<0.05),但与 DHCA 组无统计学差异(P>0.05)。与 DHCA+Cirp-/-组相比,额外给予 enarodustat 后,Bax、Caspase 9、FADD、Caspase 8 和 Caspase 3的活化被显著抑制(P<0.05),抗凋亡的Bcl-2蛋白的表达显著增加(P<0.05)。DHCA+Cirp-/-组大鼠术后SCr、BUN和血尿酸的水平显著高于DHCA组(P<0.05)。DHCA+Cirp-/-+enarodustat 组术后 SCr 和 BUN 水平显著低于 DHCA+Cirp-/-组(P<0.05),但其肾功能三项的水平与DHCA组相比皆无统计学差异(P>0.05),提示enarodustat可明显逆转Cirp-/-诱发的肾功能损害。研究结论Enarodustat可通过抑制过度凋亡部分抵消CIRP表达缺失所加剧的深低温I/R性肾损伤,这侧面证实了 CIRP可通过PHD3/HIF-1 α轴减轻DHCA心脏术后AKI。新型HIF-1α羟化酶抑制剂可能是深低温I/R后AKI的潜在防治手段。