妊娠过程中,子宫蜕膜化是妊娠成功的基本保障。蜕膜化子宫内膜基质细胞迁移受雌、孕激素及多种细胞因子调控,但多种在妊娠期升高的性激素调节蛋白,例如,卵泡抑素(Follistatin,FST)及激活素A(Activin A,Act A),是否参与蜕膜化子宫内膜基质细胞迁移调控仍不清楚。激活素A是转化生长因子β(TGF-β)超家族成员,作为性激素调节蛋白,因其促进垂体前叶腺细胞分泌卵泡刺激素(FSH)而命名。FST因抑制垂体前叶腺细胞分泌FSH而命名,由于其可与激活素A高亲和力结合,故又称激活素结合蛋白。研究显示,激活素A和FST在妊娠期子宫内膜高表达,然而,两者在蜕膜化子宫内膜基质细胞迁移过程中的作用及机制仍不清楚。因此,本论文通过体外诱导小鼠子宫内膜基质细胞蜕膜化以及原代培养妊娠小鼠蜕膜基质细胞,应用微流控技术等,探究激活素A与FST对蜕膜基质细胞迁移的影响及相关机制,为进一步阐述妊娠子宫蜕膜发育机制,以及探寻有效调控子宫蜕膜化的药物靶点提供新的研究思路和基础。一、研究方法1.体外诱导小鼠子宫内膜基质细胞蜕膜化分离培养8周龄未孕Balb/c雌鼠子宫内膜基质细胞(mESCs),免疫细胞化学染色鉴定细胞;应用雌二醇(E_2)联合孕酮(P_4)体外诱导mESCs蜕膜化。2.蜕膜基质细胞生物学活性检测CCK-8法检测细胞增殖,RTCA技术检测细胞黏附;划痕实验检测细胞创口愈合能力;Transwell小室实验和微流控技术检测细胞迁移与侵袭能力;RT-PCR和Western blotting检测细胞外基质及迁移相关蛋白表达。3.蜕膜基质细胞活化机制分析流式细胞术检测细胞内Ca~(2+)水平;RT-PCR和Western blotting检测细胞激活素经典SMAD信号通路、非SMAD信号通路(MAPK通路、PI3K/AKT-m TOR通路和Rho通路)及孕激素受体(PR)通路蛋白表达。Baricitinib分子量4.原代培养妊娠小鼠子宫蜕膜基质细胞活性检测与机制分析酶消化法分离培养妊娠6.5天小鼠子宫蜕膜基质细胞(mDSCs),细胞鉴定、活性检测与机制分析,同上述体外诱导蜕膜化小鼠子宫内膜基质细胞。5.激活素A及FST在妊娠期个体蜕膜组织表达变化分别建立正常妊娠小鼠模型与自然流产小鼠模型,检测小鼠蜕膜组织激活素A及FST表达情况。临床样本分析,检测正常孕早期女性与胎停患者蜕膜组织激活素A及FST表达情况。二、研究结果1.成功诱导体外培养小鼠子宫内膜基质细胞蜕膜化体外培养mESCs细胞抗波形蛋白染色阳性,表明属于基质细胞;雌、孕激素作用细胞后呈现典型的蜕膜样细胞形态,蜕膜化标志物催乳素表达明显升高,提示mESCs细胞成功分化为蜕膜化小鼠子宫内膜基质细胞(d-MESCs)。2.激活素A及FST对小鼠蜕膜基质细胞活性影响(1)激活素A及FST促进蜕膜基质细胞增殖;FST可诱导蜕膜基质细胞变长,向间质型细胞转变,而激活素A组无明显细胞形态学变化。(2)激活素A及FST均能抑制蜕膜基质细胞黏附,FST抑制作用更为明显;激活素A及FST均能促进蜕膜基质细胞创口愈合,诱导蜕膜基质细胞迁移与侵袭,其中FST诱导细胞迁移距离更长、方向性更明显;激活素A及FST主要通过调控MMP9、FN、Col IV、Vimentin、Ezrin及N-cadherin表达,诱导蜕膜基质细胞迁移。3.激活素A及FST调控小鼠蜕膜基质细胞活化机制(1)FST增加蜕膜基质细胞Ca~(2+)水平。(2)激活素A及FST对蜕膜基质细胞激活Lignocellulosic biofuels素经典SMAD通路信号分子无明显影响;FST可上调p-JNK/JNK蛋白比率,激活蜕膜基质细胞非SMAD途径的JNK信号,JNK抑制剂作用后,小鼠蜕膜基质细胞的迁移数量减少,迁移距离缩短,细胞迁移能力减弱。(3)FST通过激活PR通路下游的Fox O1和Ihh,参与调控蜕膜化过程。4.激活素A及FST在妊娠期个体蜕膜组织表达变化(1)在正常妊娠小鼠模型中,随着妊娠的发展,蜕膜组织激活素A与FST表达均升高;自然流产后,蜕膜组织激活素A与FST表达均下降,其中FST下降更为明显。(2)胎停患者蜕膜组织FST表达明显下降,而激活素A无明显变化。三、结论综上所述,在激活素A-FST系统(activin A-FST syDorsomorphinstem)中,与激活素A相比,FST是更有效的诱导子宫蜕膜基质细胞迁移因子,FST通过活化JNK信号诱导蜕膜基质细胞迁移,而非激活素经典SMAD信号。流产蜕膜组织FST表达下降,提示FST可作为评估妊娠早期蜕膜化发育的重要生物标志物,FST也具有治疗因蜕膜化发育不良所致流产的潜在应用价值。