酶解法因其能够特异性地分解琼脂多糖,且无有害化合物产生等优点,被认为是可持续性、规模化生产琼脂低聚糖的最主要方法。但游离琼胶酶存在一些缺点(热稳定性差,p H范围窄,水环境中的有效活性以及循环后催化活性的丧失),导致其在工业中的应用有限。因此,利用固定化技术提高酶的热稳定性、操作稳定性以及实现可重复利用性,可以降低反应成本,具有较好的工业应用前景。定向共价固定将目标酶以一定方向(远离活性中心)固定在合适的载体上,从而使酶能够更好地与底物结合。伴随着结构生物学,生物信息学以及计算机辅助方法的蓬勃发展,蛋白质的突变设计已经成为了改造酶特性的一种有效方法。本研究首先利用计算机辅助手段,通过筛选柔性、刚性和热敏区域,并结合能量计算,最终得到6个候选突变位点;将所选定的突变位点突变为半胱氨酸,并通过基因工程手段得到6个突变型β-琼胶酶Aga50D;最后以功能化磁性纳米颗粒为载体,利用巯基特异性将特定位点的半胱氨酸与载体结合,得到稳定性显著增强的定向固定化β-International Medicine琼胶酶Aga50D。主要研究结果如下:(1)利用分子动力学模拟鉴定酶分子的柔性、刚性以及热敏区域,并结合能量计算对β-琼胶酶Aga50D进行突变设计。利用B-factor因子和RMSF_(298K)识别柔性和刚性区域,再通过高低温分子动力学模拟轨迹(ΔRMSF_(323K-298K))识别热敏区域;然后借助Rosetta Cartesian DDG计算了所筛选的氨基酸突变为半胱氨酸引起的构象自由能变化(ΔDDG),确定有利的正向突变,并通过PYMOL查看氨基酸是否在分子表面。最后筛选得到在柔性区域的2个突变位点为:R66C、K588C;在刚性区域的4个突变位点为:K211C、E308C、N452C、S558C。(2)通过PCR扩增得到R66C、K211C、E308C、N452C、S558C、K588C基因,将其构建至表达载体PD0325901抑制剂p ET28a,并成功在大肠杆菌基因工程菌(BL21)进行可溶性表达;使用镍柱亲和层析后,获得较高纯度的突变体,并分别对野生型和突变型酶进行酶学性质的测定。结果表明:在6个突变设计中,有5个突变体酶活较野生酶提高,其中E308C、N452C的相对酶活分别提高了137.0%、130.2%,而K211C的相对酶活稍微降低,为98.1%;大多数突变型酶的热熔融温度(IDN-6556T_m)均低于野生型,仅有突变型酶R66C、S558C的T_m值高于野生型;野生酶和所有突变体酶的最适反应p H均为7.0,最适反应温度均为30℃。突变设计整体上对于β-琼胶酶Aga50D的酶学性质影响不大,与预期的突变设计结果一致,所得到的突变体酶可以进一步用于定向固定化。(3)通过sulfo-SMCC交联氨基化磁性纳米颗粒,得到马来酰亚胺修饰的磁性纳米颗粒(MAL-NH_2-MNPS),可以自发地与突变型β-琼胶酶Aga50D的半胱氨酸残基结合从而实现定向固定β-琼胶酶Aga50D突变型酶。固定化最优反应条件为:反应时间6 h、酶载量(酶:载体)1:50、交联试剂比例(交联剂:载体)1:50。不同突变型R66C、K211C、E308C、N452C、S558C、K588C酶的固载率分别为:51.9%,42.3%,41.4%,60.0%,44.7%,45.4%,相对酶活分别为96.7%、87.9%、60.5%、94.9%、91.2%、96.9%,具有较高的酶活保留率。在40℃及45℃的条件下,固定化酶比野生型具有更好的热稳定性。在40℃下孵育30 min及60 min后,野生酶分别保留原始酶活的79.8%和37.8%,而在孵育6 h后,几乎丧失所有酶活;固定化突变型酶S558C在40℃条件下孵育30 min及60 min后,保留原始酶活的99.5%和97.3%;孵育6 h后,仍然能够保留原始酶活的86.7%。固定化酶在重复使用5次后还保留20%～50%左右的相对酶活。在有机试剂的存在下,游离酶丧失了全部活性,而大多数固定化酶可以保留90%以上的酶活。(4)通过traut试剂交联氨基化磁性纳米颗粒得到的巯基修饰的磁性纳米颗粒(SH-NH_2-MNPS),可以自发地与突变型β-琼胶酶Aga50D上的半胱氨酸残基形成分子间二硫键从而定向固定化β-琼胶酶。固定化最优反应条件为:反应时间12 h、酶载量(酶:载体)1:50、交联试剂比例(交联剂:载体)10:50。突变型R66C、K211C、E308C、N452C、S558C、K588C酶的固载率分别为:63.5%,41.7%,42.3%,71.6%,61.9%,55.1%,相对酶活分别为92.2%,94.4%,68.3%,88.0%,81.3%,96.8%,大多数突变型酶的酶活保留率都在80%以上。在40℃和45℃条件下,固定化酶比野生型酶具有更好的热稳定性,例如在45℃下,野生酶在孵育30 min及60 min后,分别保留原始酶活的60.8%和22.2%,而在孵育6 h后,野生酶丧失全部酶活;突变型酶E308C在45℃条件下孵育30min和60 min后,分别保留原始酶活的88.8%和82.7%,孵育6 h后,固定化酶E308C仍然能够保留原始酶活的56.4%。固定化酶重复使用4次后还都残留30%以上相对酶活。在有机试剂的存在下,游离酶丧失了全部活性,而大多数固定化酶可以保留70%以上的酶活。(5)利用薄层色谱和液相质谱表征固定化β-琼胶酶Aga50D酶解产物为单一的新琼二糖。酶解产物新琼二糖具有一定的抗氧化能力,对ABTS自由基的清除能力较强,ABTS自由基清除率最大可以达到91.4%,对DPPH自由基清除率一般,最大值为59.6%,对于·OH自由基清除能力较弱,当新琼二糖达到较高浓度时,清除率仅能达到13.3%。