目的:基于气相色谱-质谱(GC-MS)非靶向代谢组学技术,通过尿液分析清肾颗粒治疗慢性肾衰竭(CRF)湿热证的代谢物质基础与相关代谢通路,并结合网络药理学相关研究,为阐明清肾颗粒治疗CRF湿热证的效应物质及作用机制提供科学依据。方法:1.临床研究:收集CRF湿热证患者、正常人晨尿各5例,用低温高速离心法处理获取样本,在对样本预处理后,利用GC-MS技术的非靶向代谢组学方法获取和预处理代谢组学数据。随后通过多元统计分析方法,先使用无监督的主成分分析(PCA)来研究样本区间的总体分布特征,并评估整个分析过程的稳定性。接着使用有监确认细节督的偏最小二乘法(PLS-DA)和正交偏最小二乘法(OPLS-DA)来比较各组间代谢轮廓的整体区别,从而找出组间的差异代谢物。通过OPLS-DA法获取变量权重值(VIP),筛选出VIP>1.0,且T检验P<0.05的差异代谢物,并利用KEGG数据库开展代谢通路的富集分析。2.实selleck激酶抑制剂验研究:将40只2月龄雄性SPF级SD大鼠适应性喂养1周后,按1:3随机分为正常组10只,造模组30只。用腺嘌呤灌胃造模组4周后随机分为模型组和清肾颗粒组,每组15只。在清肾颗粒给药12周后,每组送检10只。末次给药12h后利用清洁代谢笼收集大鼠24h尿液用于代谢组学研究。次日对三组大鼠进行腹主动脉采血,检测血清肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN),留取肾组织样本,HE、Masson染色观察大鼠肾脏组织病理损伤的情况。运用GC-MS的非靶向代谢组学方法,结合主成分分析、偏最小二乘判别分析和正交偏最小二乘法分析等多元统计方法,筛选VIP>1.0,且T检验P<0.05的代谢物,比较正常组、模型组、清肾颗粒组大鼠尿液的代谢谱,分析不同组别代谢物的变化。并使用KEGG数据库进行代谢通路的富集分析,研究清肾颗粒延缓肾纤维化的代谢途径。3.代谢组学与网络药理学结合分析:结合课题组前期清肾颗粒网络药理学相关研究,利用韦恩图整合网络药理学及代谢组学KEGG通路富集分析数据。结果:1临床研究:CRF湿热证患者与正常人尿液对比筛选得到的差异代谢物共有168个,通过KEGG、HMDB等数据库鉴定比对后得到67个差异代谢物,主要为有机酸类、有机氧化物等。将获得的差异代谢物进行KEGG通路富集分析,筛选标准为P<0.05,总共得到有意义的KEGG通路38条。按P值从小到大排序其中排在前10位的代谢通路分别是癌症中的中枢碳代谢,蛋白质消化吸收,氨酰t RNA生物合成,ATP结合盒转运蛋白,矿物质吸收,突触囊泡周期,d-氨基酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,乙醛酸和二羧酸代谢,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢。2实验研究:2.1 Scr、BUN:相较于正常组,模型组和清肾颗粒组大鼠Scr、BUN均显著上升(P<0.05)。而相较于模型组,清肾颗粒组大鼠Scr、BUN则显著下降(P<0.05)。2.2肾脏病理:正常组大鼠的肾小球、肾小管和肾间质均结构正常,而模型组大鼠则表现出系膜增生、节段性硬化、局部肾小管萎缩以及肾小管代偿性肥大,此外,肾间质中还出现大面积蓝染胶原纤维。与模型组相比,清肾颗粒组肾脏病理损伤减轻。2.3代谢组学:在满足VIP值>1及P<0.05的条件下,筛选模型组和正常组得到差异代谢物103个,在Marine biomaterialsKEGG、HMDB等数据库检索比对,鉴定得到73个差异代谢物,再对差异代谢物分析结果进行KEGG通路富集分析得到有意义的KEGG通路28条(P<0.05)。以同样的方法筛选清肾颗粒组和模型组,得到45个差异代谢物,鉴定后为25个差异代谢物,得到有意义的KEGG通路23条(P<0.05)。将两部分鉴定得到的差异代谢物取交集,得到8种差异代谢物,分别为富马酸、苹果酸、N-乙酰-L-谷氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、尿嘧啶、黄尿酸、戊二酸。这些差异代谢物的含量在模型组下调,在清肾颗粒组上调并趋于正常组。将不同组之间得到的KEGG通路取交集,得到共同的KEGG通路14条,分别为癌症中的中枢碳代谢、精氨酸生物合成、氨酰t RNA生物合成、丙氨酸,天门冬氨酸和谷氨酸代谢、乙醛酸盐和二羧酸盐代谢、肾细胞癌、柠檬酸循环(TCA循环)、胰高血糖素信号通路、蛋白质消化吸收、γ氨基丁酸能突触、ATP结合盒转运蛋白、缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸生物合成、嘧啶代谢、酪氨酸代谢。3.代谢组学与网络药理学结合分析结果参考课题组之前已完成的清肾颗粒治疗CRF湿热证的网络药理学研究,通过KEGG通路富集分析,以P<0.05为筛选标准,共得到147条通路。通过整合网络药理学及代谢组学KEGG通路富集分析数据,最终得到4条通路,包括癌症中的中枢碳代谢、蛋白质消化吸收、ATP结合盒转运蛋白、肾细胞癌。结论:1.基于GC-MS的尿液代谢组学研究,发现清肾颗粒治疗CRF湿热证潜在的生物标志物有8种,分别为富马酸、苹果酸、N-乙酰-L-谷氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、尿嘧啶、黄尿酸、戊二酸。2.代谢组学结合网络药理学分析表明清肾颗粒治疗CRF湿热证的机制与癌症中的中枢碳代谢、蛋白质消化吸收等代谢通路有关。3.清肾颗粒调节氨基酸代谢,是延缓肾纤维化进展的重要靶点之一。