研究背景与目的:骨质疏松症(osteoporosis,OP)是全球最常见的骨病之一,其特征是低骨密度和易发生病理性骨折,尤其在绝经后的女性和老年男性中具有较高的发病率。根据2018年我国骨质疏松流行病学统计,50岁以上人群OP患病率超过19.2%,尤其在女性中患病率远远高于平均患病率,并且我国低骨量人数也不在少数~([1])。OP是一种慢性疾病,一旦发现时往往患者骨质疏松已较为严重,极易发生脆性骨折,其具有较高的致残率和死亡率,这将会给老年人的生存质量带来严重影响,并会给家庭和社会带来沉重的负担。对于骨质疏松的治疗,目前以药物干预为主,包括双膦酸盐、雌激素相关治疗、甲状旁腺激素类似物、RANKL抑制剂、鲑鱼降钙素等药物~([2])。但是治疗周期往往较长,起效较慢,并且伴有一定的毒副作用(如肝肾功能损伤、颌骨坏死等)。因此,对于骨质疏松的治疗仍需进一步探索新的治疗药物。铁死亡是近年来新发现的受基因调控的细胞死亡形式之一,大量研究表明铁死亡与多种疾病密切相关,其中在肿瘤疾病的研究最多,包括肾癌、肺癌、乳腺癌等。此外,还在其它疾病中也有相关研究,包括帕金森病、阿尔兹海默症、心肌损伤、肾损伤等疾病,并取得了一定的研究成果~([3])。并且,随着对铁死亡分子机制的深入研究,人们也逐渐意识到铁死亡在许多除肿瘤以外的疾病中也可能扮演了重要的角色。另外,针对于铁死亡的治疗方法也逐渐被提出来,大量研究表明在肿瘤疾病中使用铁死亡激动剂或抑制剂,能够促进或抑制疾病的发展~([4])。因此,靶向铁死亡已逐渐成为目前治疗许多疾病的研究热点。然而,目前关于铁死亡与骨质疏松的研究较少,铁死亡在骨质疏松中的作用机制仍不明确。因此,本研究旨在通过生物信息学技术从GEO数据库中挖掘出骨质疏松铁死亡相关的生物标志物,并对生物标志物进行一系列分析,试图为未来骨质疏松的诊断和治疗提供新方向。材料与方法:首先从公共数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)中下载GSE56815数据集的基因表达信息和临床信息,并从Ferr Db数据库和已发表文章中下载并整理铁死亡相关基因。以校正后的P值<0.05为筛选标准,使用R软件筛选出差异表达基因(DEGs)。将DEGs与铁死亡基因集取交集并绘制韦恩图(Venn plot),获得铁死亡相关DEGs。通过R软件对铁死亡相关DEGs进行GO功能和KEGG通路富集分析。利用铁死亡相关DEGs构建随机森林模型进一步筛选关键铁死亡基因。使用R软件计算关键铁死亡基因的相关性系数,进行基因间的相关性分析,并利用Wilcox秩和检验对结果进行显著性分析,当P<0.05时认为是显著相关。从数据库中收集整理与关键铁死亡基因相互作用的TF、miRNA和lnc RNA,利用Cytoscape软件构建lnc RNA-miRNA-m RNA-TF调控网络。通过LASSO回归构建疾病诊断模型,使用R软件绘制ROC曲线评估诊断效能,并利用外部数据集GSE7429验证诊断模型的可靠性。通过分子对接技术从Drugbank数据库中筛选可同时与所有关键铁死亡基因都具有良好对接评分的小分子化合物,筛选条件为Affinity≤-7 kcal/mol。最后,通过动物实验验证关键铁死亡基因在骨质疏松与正常模型中的m RNA表达水平。我们将SD雌大鼠分为Sham组(假手术组)和OVX组(卵巢切除术组),OVX组中SD雌大鼠行双侧卵巢切除术构建骨质疏松模型,使用Micro-CT检测验证模型骨质疏松,提取模型大鼠外周血液的单核细胞进行实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测,验证关键铁死亡基因在骨质疏松与正常模型中的m RNA表达水平。结果:从GSE56815数据集中共筛选出400个DEGs,包括282个下调基因和118个上调基因,并初步筛选出6个铁死亡相关DEGs。GO功能及KEGG通路富集分析表明,6个铁死亡相关DEGs在GO功能分析上主要富集在维持铁离子稳态、铜离子结合等功能,KEGG通路分析主要富集在铁死亡、卟啉代谢等相关通路。构建随机森林模型进一步筛选并确定了5个关键铁死亡基因,包括CP、FLT3、HAMP、HMOX1和SLC2A3。基因相关性分析发现CP(cor=-0.41)和FLT3(cor=-0.27)均与SLC2A3显著负相关,HMOX1与HAMP显著正相关(cor=0.26),但是这5个关键铁死亡基因之间的相关密切程度较低。lnc RNA-miRNA-mBiomoleculesRNA-TF调控网络显示BAZ1B可以与4个关键铁死亡基因(包括CP,SLC2A3,HAMP和HMOX1)相互作用,而STAT3可以与其中3个关键铁死亡基因(包括FLT3,HAMP和HMOX1)相互作用。通过LASSO回归构建的疾病诊断模型ROC曲线下面积(AUC)为0.8956,外部验证集GSE7429的疾病诊断模型ROC曲线下面积(AUC)为0.PUN301196900,结果表明该模型的诊断效能良好。使用分子对接技术从Drug Bank数据库中筛选出3种小分子化合物可同时与5个关键铁死亡基因具有良好的对接评分,包括NADH、Midostaurin和Nintedanib化合物。Micro-CT检测结果显示OVX组与Sham组相比,OVX组的Tb.N、BV/TV和BMD均明显下降,而Tb.Sp和Tb.Pf显著增加,结果表明成功构建大鼠骨质疏松模型。q RT-PCR实验显示OVX组与Sham组相比,CP和FLT3的m RNA表达水平显著上调,而HAMP、HMOX1和SLC2A3的m RNA表达水平显著下调。寻找更多因此,q RT-PCR结果与生物信息学数据分析结果一致。结论:本研究确定了5个关键铁死亡基因可以作为骨质疏松的生物标志物,包括CP、FLT3、HAMP、HMOX1和SLC2A3,可以为未来骨质疏松症的早期诊断和治疗提供新的线索。