糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)又称粘多糖,是由已糖醛酸和N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰基半乳糖胺的重复二糖单元组成的一种长线形杂多糖。根据单糖残基种类,糖苷键类型以及硫酸基的数目与分布,糖胺聚糖可分为:透明质酸(hyaluronic acid,HA)、硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)、硫酸皮肤素(dermatan sulfate,DS)、硫酸角质素(keratin sulfate,KS)、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)和肝素(heparin,HP)。糖胺聚糖与生长因子、趋化因子等生物信号分子相互作用,在抗肿瘤、抗凝血、抗炎症和抗衰老等方面有着广泛的临床应用。糖胺聚糖合酶(glycosaminoglycan polymerase)是催化GAGs生物合成的糖基转移酶的统称。在细胞内,糖胺聚糖合酶通过将单糖从单糖供体上转移到糖链末端,合成各类GAGs骨架。糖胺聚糖合酶作为糖工程中重要的工具酶分子,已广泛应用于肝素、软骨素和透明质酸的体外酶法合成及细胞工厂的构建等。然而目前被发掘且完成了催化特性表征的糖胺聚糖合酶数量非常有限(仅有大约40余种),加之天然酶分子严格的底物特异性,较低的催化活性和异源表达水平表达,使得发掘新来源的糖胺聚糖合酶元件,或通过改造现有的酶分子获得可以高效合成特定结构的低聚糖的糖胺聚糖合酶具有深刻的意义。蛋白质定向进化是指利用人工驱动的进化来改造蛋白质的功能和性质的方法。通过构建突变蛋白质库,结合高通量筛选技术,可以在较短时间内获得新功能的蛋白质。更“聪明”的突变文库及更高效的活性筛选方法,是提升定向进化成功率的两个关键因素。筛选获得理想表型的突变蛋白在GNE-140作用大多数情况下是一个随机过程,突变文库丰度medium entropy alloy的提升可以增加获得理想表型的机率,但也增加了筛选的难度和成本。因此,开发高通量的筛选方法不但可以大大提高定向进化的成功率,而且直接决定了从大型突变库中获取理想表型的效率,减少时间和成本。但是囿于与糖苷键的形成相关的荧光和吸光度没有显著变化,导致高通量分析糖胺聚糖骨架合成过程中转糖基的反应极具挑战性,严重阻碍了利用定向进化提升相关糖基转移酶催化活性,拓宽其底物范围等相关研究。因此开发高通量的糖胺聚糖合成酶活性分析方法并应用于糖链合成关键酶的发掘与定向进化具有重要的应用价值。本论文基于以上背景展开,研究内容包括:1.基于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168,B.subtilis 168)的软骨素合酶活性快速分析方法的建立及其在软骨素合酶发掘中的应用。(1)基于枯草芽孢杆菌的软骨素合酶活性快速分析方法的建立:课题组前期通过代谢工程改造,已构建完成可利用培养基中叠氮单糖合成携带叠氮软骨素骨架的工程枯草芽孢杆菌:BS168SSAC。该菌株经诱导表达双功能软骨素合酶(E.coli K4 capsular polysaccharide polymerase,KfoC)后,利用外源的 N-(4-戊炔基)-叠氮乙酰氨基半乳糖(N-(4-pentynoyl)-azidoacetyl-galactosamine,Ac4GalNAz)合成叠氮基团修饰的软骨素骨架多糖。利用叠氮基团易与炔基基团发生点击化学反应的特点,可以实现含炔基的荧光标记物与细菌携带的叠氮荚膜多糖共价结合。本论文以该工程菌株出发,经过一系列尝试,成功将软骨素合酶的酶活与叠氮软骨素的荧光强度相关联,建立了基于枯草芽孢杆菌的软骨素合酶活性快速分析方法。(2)基于枯草芽孢杆菌的软骨素合酶活性快速分析方法的优化:本论文在探究了筛选过程中的最适诱导时间及非天然可点击标记单糖Ac4GalNAz的浓度后,对宿主细胞内软骨素骨架合成路径进行了优化。在最优筛选条件下,携带叠氮多糖菌体的荧光数据分析与对照菌株比较表现出更显著的统计学差异。(3)基于枯草芽孢杆菌的软骨素合酶活性快速分析方法在新型软骨素合酶发掘中的应用:绘制软骨素合酶的蛋白序列进化树,根据其中亲缘关系的远近,建立软骨素合酶筛选文库(10种与软骨素合酶编码基因相似度较高的基因)。利用优化完成的活性快速分析方法对文库进行高效筛选,确定6个疑似软骨素合酶编码基因。随后,借助大肠杆菌表达系统表征这些重组酶分子的确具有软骨素合酶活性。至此,我们利用代谢工程改造的枯草芽孢杆菌,通过点击化学反应标记非天然基团的多糖,建立了一种高效的软骨素合酶筛选方法,并筛选获得6个软骨素合酶家族新成员。2.基于大肠杆菌(Escherichia coli O10:K5(L):H4,E.coli K5)的肝素合酶活性高通量筛选方法的建立及其在肝素合酶定向进化中的应用。(1)基于大肠杆菌的肝素合酶活性高通量筛选方法的建立:基于枯草芽孢杆菌的软骨素合酶活性快速分析方法成功发掘6个新型软骨素合酶后,我们尝试基于类似原理进一步提高筛选效率以适应更高样本量突变文库,进而实现肝素合酶的随机定向进化。课题selleckchem Mirdametinib组通过一系列代谢工程改造已构建完成可利用培养基中叠氮单糖合成携带叠氮肝素骨架的工程E.coli K5,并命名为K5SSAH。该菌株在诱导表达巴斯德氏杆菌双功能肝素合酶2(Pasteurella multocida heparosan synthases 2,PmHS2)后,利用外源的N-(4-戊炔基)叠氮基乙酰基氨基葡萄糖(N-(4-pentynoyl)-azidoacetyl-glucosamine,Ac4GlcNAz)可产生叠氮基团修饰的肝素骨架,炔基荧光标记物可与细菌携带的叠氮肝素多糖共价结合。本论文以该工程菌株出发,经过一系列尝试,成功将肝素合酶活性与菌体荧光强度相关联,建立了基于大肠杆菌的肝素合酶活性高通量筛选方法。(2)基于大肠杆菌的肝素合酶活性高通量筛选方法的优化:本论文探究了筛选过程中的最适诱导时间及非天然可点击标记单糖AC4GlcNAz浓度,以提高携带叠氮多糖菌株与对照菌株之间的荧光数据差异。(3)基于大肠杆菌的肝素合酶活性高通量筛选方法在肝素合酶定向进化中的应用:以PmHS2为定向进化出发蛋白,通过多序列比对、丙氨酸扫描并结合PmHS2的高级结构,建立肝素合酶筛选文库(8000种不同氨基酸组合的PmHS2突变序列)。利用优化完成的活性高通量筛选方法对文库进行高通量筛选。通过荧光激活细胞分选技术(fluorescence activated cell sorting technology,FACS)富集相对荧光强度较高的细胞,完成初筛;通过酶标仪分析富集后的重组细胞的荧光强度完成复筛。成功筛选获得2个疑似活性提高的肝素合酶突变基因。随后,借助大肠杆菌表达系统,分别重组表达该疑似基因,表征这些突变酶分子确定其GlcNAc转移酶活性较野生型PmHS2分别提升了 4.48倍和2.63倍。随后,设计和构建了其组合突变体中对应的单位点突变体以确定单个位点突变后对于PmHS2活性提高的贡献程度。至此,我们利用代谢工程改造的E.coli K5,通过点击化学反应标记非天然基团的多糖,建立了一种高通量的肝素合酶筛选方法,筛选获得2个活性提高的肝素合酶突变体并发现影响PmHS2活性的关键氨基酸位点。上述高活性突变体的获得,证明了我们建立的筛选方法有效应用于肝素合酶高通量筛选的潜力。