对香豆酸(p-CA)是一种具有生理活性的酚酸类化合物,也是众多苯丙素类化合物的合成前体,在营养、制药、材料和化学工业中有许多重要的应用。在微生物中合成对香豆酸有两条生GSK2118436作用物途径,分别以L-苯丙氨酸(PAL支路)和L-酪氨酸(TAL支路)为前体。目前微生物合成对香豆酸的最高产量是利用酿酒酵母工程菌通过协同苯丙氨酸解氨酶(PAL)和酪氨酸解氨酶(TAL)途径完成。在大肠杆菌(Escherichiacoli)中,多以酪氨酸为底物转化合成香豆酸。在本文中,以高产L-苯丙氨酸的大肠杆菌作为底盘菌株,构建基于PAL途径生产对香豆酸的工程菌株,具体结果如下:(1)PAL支路合成酶的筛选和体外测评。在9种候选PAL中,来自粘红酵母(RgPAL)、拟南芥(AtPAL2)、蓝藻细菌(AvPAL)的PAL比酶活分别为3.11、1.88和1.60 U·mg~(-1),其中AtPAL2酶能更好地在E.coli中可溶性表达而被选择。筛选出5种Captisol体外候选C4H,综合可溶性表达和酶活测试结果,选择黄花石蒜来源的LauC4H。进一步利用“GSTSSGSG”融合表达策略,优化了还原伴侣(AtATR2)和LauC4H的连接,转化得13.48μM对香豆酸。此外,对AtPAL2和LauC4H酶的蛋白表达条件和体外催化能力进行测试。当菌浓OD600=0.8时添加0.4 mM的IPTG,分别在25℃和16aviation medicine℃下诱导15 h,AtPAL2和LauC4H可溶性表达最好;测试AtPAL2和LauC4H催化能力最佳条件分别在 50℃、pH=9 和 25℃、pH=7.5。(2)对香豆酸体外合成模块中限速酶的改造。利用纯化后等量的AtPAL2和LauC4H进行体外转化L-苯丙氨酸,通过液质联用(HPLC-MS)和高效液相色谱(HPLC)检测到对香豆酸,验证了对香豆酸合成路径的可行性。当LauC4H浓度增加2倍时,其L-苯丙氨酸到p-CA初始反应速率增加1.9倍;同时AtPAL2的k_(cat)/K_m 比LauC4H高22倍,综合确定LauC4H为限速酶。通过对LauC4H酶的半理性设计,筛选出11个候选残基,其中 LauC4H~(V91A)、LauC4H~(V278S)、LauC4H~(S187T)使p-CA 的产量分别达到 12.13μM、11.65 μM、15.37 μM,比LauC4Hwt分别提高42.1%、36.4%、80%,而三个突变体随机组合的双突变体和三突变体效果不佳。最后,对LauC4H~(S187T)进行六种“N”端修饰。经验证“KKK”修饰下对香豆酸产量相较于原始菌株提高了 2.88倍,有助于提高LauC4H的正确折叠和定位。(3)p-CA合成菌株的构建与优化。构建质粒pEMAL7转化到E.coli JNYPQ-5中,获得的菌株JNYPQ-12能够利用葡萄糖合成p-CA。用不同强度的启动子调整AtPAL2与LauC4H的表达水平,当AtPAL2和LauC4H分别以PT5和Ptac组合时,恒温25℃发酵,p-CA产量为15.7 μM。研究发现NADPH对p-CA的生产起着关键的作用。为增强辅因子NADPH的供给,过表达zwf和gnd基因,工程菌株E.coli JNYPQ-16的NADP+/NADPH比值比JNYPQ-12提高了 83.9%,摇瓶水平达到38.4 μM。(4)5 L发酵罐测试菌株发酵能力。从温度和培养基中酵母粉的添加浓度优化底盘菌生产L-苯丙氨酸的能力,酵母粉浓度增加至5 g/L,菌体先在33.5℃下生长至OD_(610)为20左右再转为38.5℃发酵时,L-苯丙氨酸的产量、得率以及生产强度分别提高至64.9 g/L、0.259 g·g~(-1) 和 1.47g/L/h。初步评估 IPTG 添加时间对工程菌E.coli JNYPQ-16产p-CA的影响,当OD_(610)为10时,添加IPTG诱导,p-CA产量达到378.6μM,平均生产强度达1.29mg/L/h。本研究通过对PAL支路合成酶PAL和C4H的筛选和改造,使其在大肠杆菌中更好地表达。进而优化PAL支路在L-苯丙氨酸底盘菌中的表达,实现对香豆酸从头积累,为对香豆酸及相关苯丙素类化合物的微生物合成奠定一定基础。对C4H酶的功能改造,以及提升p450对芳烃的羟基化反应效率提供一定参考。