研究背景和意义ANXA6是膜联蛋白家族中最大的成员,在大多数组织中均高度表达。ANXA6主要位于质膜和内吞体腔室,与多种蛋白质和脂质相互作用,形成膜结构域、信号复合物,介导瞬时膜-肌动蛋白相互作用,维持细胞内胆固醇稳态。在一些细胞和动物模型中,ANXA6和其他一些膜联蛋白对膜修复至关重要。前期,本课题组筛选并验证宿主蛋白ANXA6与大肠杆菌0157:H7 EspF蛋白相互作用,发现EspF或ANXA6的组成型表达和EspF-ANXA6的共表达均可降低紧密连接蛋白ZO-1和occludin的水平,破坏ZO-1的分布。但ANXA6蛋白在紧密连接破坏过程中的作用还不清楚。鉴于此,本论文拟采取CRplasma medicineISPR/Cas9系统构建稳定敲除anxa6基因的Caco-2细胞株,研究anxa6基因缺失后细胞的增殖和迁移能力,探索EspF蛋白与ANXA6蛋白互作如何影响细胞的紧密连接。方法研究(1)根据CRISPR/Cas9系统的靶向原理,设计三条针对anxa6基因外显子的sgRNA序列,并构建LentiCRISPRv2-sgRNA重组质粒,将质粒转化至感受态细胞Stbl3中,挑菌扩大培养,小提质Smoothened Agonist研究购买粒,送测序,验证。(2)用慢病毒包装质粒pVSVG和pCD与LentiCRISPRv2-sgRNA重组质粒共同转染到293T细胞中,合成慢病毒。收集慢病毒并感染Caco-2细胞,用嘌呤霉素筛选带抗性细胞,通过有限稀释法产生单克隆细胞。并通过DNA测序检测Caco-2细胞株anxa6基因的缺失情况,以及用WB检测ANXA6蛋白的表达情况。(3)用在线脱靶效应评估工具Off-Spotter,针对10个潜在脱靶位点进行DNA片段的提取以及测序,验证Caco-2anxa6-/-绷胞是否存在脱靶效应。(4)用CCK-8试剂盒检测CacoGalunisertib-2anxa6-/-细胞的增殖活性,并通过划痕实验检测Caco-2anxa6-/-细胞的迁移能力。(5)通过免疫荧光技术以及WB检测EspF质粒转染进Caco-2-V2细胞和Caco-2anxa6-/-细胞后紧密连接蛋白的分布情况以及表达水平。研究结果(1)构建了 LentiCRISPRv2-sgRNA重组慢病毒表达载体质粒。(2)包装了慢病毒,将慢病毒感染Caco-2细胞后用嘌呤霉素筛选出带抗性单克隆细胞,并获得一株anxa6基因缺失5个碱基的Caco-2细胞株。(3)脱靶效应评估结果显示预测的10个脱靶位点均无脱靶现象。(4)通过CCK-8试剂盒检测Caco-2anxa6-/-细胞增殖活力发现,Caco-2anxa6-/-细胞与原始株Caco-2细胞在增殖方面没有显著性差异;通过细胞划痕实验检测细胞迁移能力发现,Caco-2anxa6-/-细胞与原始株Caco-2细胞相比较,细胞迁移速率明显降低。(5)EspF质粒转染Caco-2-V2细胞和Caco-2anxa6-/-细胞后,采用免疫荧光以及WB技术,检测紧密连接蛋白的分布情况以及表达水平,研究表明,无论是转染pEGFP-EspF质粒,还是ANXA6蛋白的不表达，细胞的紧密连接相关蛋白均会受到影响。研究结论本文构建了anxa6基因稳定敲除的Caco-2细胞株,验证表明,在基因敲除过程中没有产生脱靶效应;anxa6基因缺失后,细胞的迁移能力受到影响;初步探索了 ANXA6蛋白在紧密连接分布中的作用以及相关通路蛋白的表达情况,为进一步研究大肠杆菌O157:H7通过EspF-ANXA6互作介导宿主肠屏障损伤分子机制提供技术支持。