背景:随着居民生活水平的提高及饮食结构的改变,结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)的发病率及死亡率逐年增加,其发病率已跃居肿瘤中第三位,死亡率位居第四位。CRC无特异的临床表现,内镜检查和病理诊断是金标准,其它辅助诊断依据包括腹部CT、腹部MRI及癌胚抗原等血清肿瘤标志物。腹部CT和MRI对CRC的诊断缺乏特异性,价格高,且存在射线辐射。血清肿瘤标记物适用于CRCFerrostatin-1临床试验的筛查,但其对CRC诊断的灵敏度和特异性一般。腹部CT和MRI对CRC肝脏转移及肺转移的诊断有一定优势,但对CRC腹膜转移诊断的灵敏度和特异性一般。因此,新的CRC特异性标志物及其检测方法在CRC及其腹膜转移的诊断方面拥有广阔的应用前景。Micro RNA-21与CRC关系密切。研究表明,CRC组织中micro RNA-21的含量明显高于癌旁组织,micro RNA-21促进CRC增殖与分化;表达micro RNA-21高的CRC与较晚分期、较差预后、化疗不敏感及较短的生存期密切相关。有研究报道micro RNA-21作为CRC诊断标志物的灵敏度和特异性均高于癌胚抗原。众多关于micro RNA-21与CRC的研究结果表明micro RNA-21与CRC密切相关,可作为CRC诊断及预后评估的标志物。腹膜转移是CRC的晚期表现,其诊断主要依靠手术探查和活检病理。由于腹部CT和MRI等方法对腹膜转移诊断的效果一般,很多腹膜转移直至开腹探查时才被发现,而此时手术及麻醉已给病人造成较大的创伤。因此,在较小创伤或无创伤的情况下诊断腹膜转移至关重要。腹膜转移的CRC病人往往拥有严重消瘦和体重骤减的特点,即腹膜转移病人存在严重的能量代谢紊乱。ATP是能量代谢的产物和标志物,且与CRC关系密切。ATP分为细胞内ATP和细胞外ATP(Extracellular ATP,e ATP)。e ATP是指细胞外的ATP,比如组织间隙和血浆中的ATP。有文献报道,正常组织间隙不含ATP或含有极少量的ATP,而肿瘤原发部位或者转移部位e ATP含量很高,是正常组织间隙中ATP的千倍甚至万倍。高浓度的e ATP与CRC细胞表面的腺苷能受体P2RX7结合,激活信号通路,促进CRC增殖、浸润、转移和耐药的发生。本研究通过构建新的micro RNA-21和ATP检测方法并利用该方法检测病人血液或者体液中micro RNA-21和ATP,从而实现对CRC及其腹膜转移的诊断。国内外学者开发多种检测micro RNA和ATP的方法,但这些方法多存在检测过程复杂、耗时、成本较高、检测限(Limit of detection,LOD)一般及对设备要求高等不足。本研究利用碱基互补配对原则构建基于双发夹连接介导等温扩增反应(Dual hairpin ligation-induced isothermal amplification,DHLA)的micro RNA-21和ATP检测方法。这两种方法具有灵敏度高、特异性好、设计简单、容易操作及设备要求低等优点。使用构建的方法检测细胞系及实际病人血浆中的micro RNA-21和ATP发现CRC细胞系micro RNA-21表达量高于正常结肠粘膜细胞系,CRC病人血浆中micro RNA-21的含量高于健康对照者;CRC细胞主动获取培养液中ATP,而正常结肠粘膜细胞分泌ATP至培养液;腹膜转移CRC病人血浆中的ATP含量明显高于早期CRC病人血浆中ATP。上述结果为CRC的诊断及CRC腹膜转移的诊断开辟新的方向。方法:1.构建基于DHLA的micro RNA-21检测,具体方法如下:(1)利用碱基互补配对原则设计检测所用的模板链和引物,使用Nupack在线软件验证。(2)模板链的浓度、模板链之间的浓度比、指数扩增反应温度、连接酶用量及引物链浓度的优化:优化的模板链浓度为60 n M、30 n M、15 n M和3 n M;优化的模板链A和模板链B的浓度比例为2:1、1:1及1:2;优化的引物混合物浓度为1.6μM、1.2μM、0.8μM和0.4μM;优化的指数扩增反应的温度为58℃、60℃、62℃、63℃;优化的Bst 2.0 DNA聚合酶的量为1.5μL和2.0μL。(3)Micro RNA-21检测的LOD及荧光曲线最大斜率时间(Point of inflection,POI)与micro RNA-21浓度线性关系:逐级稀释不同浓度的micro RNA-21为实验组,超纯水为阴性对照,按照优化后的条件实验,获得LOD及micro RNA-21浓度与POI值之间的线性关系。(4)Micro RNA-21检测的特异性分析:选择生物体内常见的micro RNA(如micro RNA-141、let-7d和micro RNA-200b)及超纯水作为对照,按照优化后的条件实验。2.构建基于DHLA的ATP检测,具体方法如下:(1)模板链之间的浓度比、连接时间及连接酶用量的优化:模板链P1和P2的浓度为60 n M,选择优化的模板链P3的浓度为30 n M、60 n M、120 n M和180n M;选择优化的T4 DNA连接酶浓度为0.016 U/μL、0.16 U/μL、1.6 U/μL及16U/μL;选择优化的连接时间为30 min、60 min、90 min和120 min(2)ATP检测的LOD及Cq值与ATP浓度线性关系:逐级稀释不同浓度的ATP为实验组,不含ATP的超纯水为阴性对照,按照优化后的条件实验,获得LOD及ATP浓度与Cq值之间的线性关系。(3)ATP检测的特异性分析:以ATP的类似物(GTP、UTP、CTP和腺苷)及超纯水作为阴性对照,按照优化后的条件实验。3.结肠癌及正常结肠粘膜细胞系中micro RNA-21和ATP:(1)体外培养结肠癌细胞SW 620和DLD-1及正常结肠粘膜细胞FHC。(2)使用柱式micro RNA提取试剂盒提取SW 620、DLD-1及FHC细胞中micro RNA;超声波裂解方法获取细胞中ATP,离心获取待测培养液。(3)使用构建的micro RNA-21及ATP检测方法检测细胞系中mciro RNA-21及细胞系和培养液中ATP。4.CRC病人血浆中micro RNA-21和ATP:(1)使用抗凝血管抽取晨起、空腹状态的10例CRC病人及5例健康志愿者血液;使用柱式micro RNA提取试剂盒提取血浆中的micro RNA。(2)使用抗凝血管抽取晨起、空腹状态的10例早期CRC病人及5例腹膜转移CRC病人血液;通过静置及多次离心获取待测血浆。(3)使用构建的micro RNA-21及ATP检测方法检测血浆中mciro RNA-21及ATP。结果:1.基于DHLA的micro RNA-21检测的LOD在~a M水平,特异性好,可区分不同种类的micro RNA。2.基于DHLA的micro RNA-21检测拥有较小的基质效应,可检测结肠细胞及CRC病人血浆中的micro RNA-21。3.基于DHLA的ATP检测的LOD在~f M水平,特异性好,可区分ATP与其类似物。4.基于DHLA的ATP检测拥有较小的基质效应,可检测结肠细胞系及CRC病人血浆中Abiotic resistance的ATP。5.CRC细胞系micro RNA-21表达量高于正常结肠粘BAY 73-4506体内膜细胞系,对比SW 620细胞,DLD-1细胞低表达micro RNA-21。6.CRC病人血浆中的micro RNA-21含量较健康志愿者血浆高。7.CRC细胞获取培养液中ATP,正常结肠粘膜细胞分泌ATP至培养液。8.腹膜转移CRC病人血浆中的ATP浓度明显高于早期CRC血浆中ATP浓度。结论:1.基于DHLA的micro RNA-21和ATP检测,拥有超高的灵敏度和较好的特异性,拥有较小的基质效应,可检测生物样本中的micro RNA-21和ATP。2.对比SW 620,DLD-1低表达micro RNA-21,CRC病人血浆中micro RNA-21含量较健康志愿者高,为CRC诊断提供新的标志物及检测方法。3.CRC细胞获取培养液中ATP,正常结肠粘膜细胞分泌ATP至培养液;腹膜转移CRC病人血浆中ATP较早期CRC病人血浆中ATP含量高,为CRC腹膜转移的诊断提供新的方法及研究方向。4.构建的基于DHLA的micro RNA-21和ATP检测,为试剂盒的开发提供依据,为CRC的社区筛查及CRC病人居家自测提供新的思路。