目的：阐明片仔癀中的蛋白质组，定量分析其中的特征胰酶水解肽以提高片仔癀的质量控制水平。方法：优化总蛋白质提取条件，采用二辛可宁酸 （BCA）法测定总蛋白含量，利用鸟枪法蛋白质组学表征片仔癀的蛋白质组，并进一步选择含量较高、稳定性好、长度适宜的特征多肽作为目标分析物，采用在线能量分辨patient-centered medical home质谱法（online ER-MS）优化特征肽的离子对及最佳碰撞能，建立反相液相色谱-选择反应监测（RPLC-SRM）定量分析方法，测定11批片仔癀中目标多肽的含量。结果：利用Uniprot数据库，从片仔癀中共鉴定了来源于200个蛋白质的343个肽段，以酶和骨架蛋白为主；筛选得到ALSSALHER、TLLEGEESR 和VAPLGEEFR 3个特征肽，以其作为目标分析物进行定量分析，online ER-MS优化3个特征肽的定量参数离子对分别为m/z 492.3→799.4、517.3→819.4和509.3→637.3，寻找更多碰撞能分别为25.0AG-221供应商、24.4、28.6 eV。方法学验证符合定量要求，3个多肽类成分在各批片仔癀样品中均被检出（ALSSALHER：0.06～0.44 μg·g~(–1)；TLLEGEESR：0.08～0.26 μg·g~(–1)；VAPLGEEFR：0.27～1.09 μg·g~(–1)），含量差异较小，其中特征肽VAPLGEEFR的含量较高。结论：建立的方法可靠，可为富含蛋白类成分的中药制剂的质量评价提供思路与方法。