放疗是治疗恶性肿瘤常用的方法之一,然而电离辐射(Ionizing radiation,IR)会引起肿瘤细胞的辐射抗性及损伤正常组织细胞,达不到预期的治疗效果。如何提高肿瘤细胞辐射敏感性以及减轻辐射对正常组织细胞损伤medical grade honey,已成为放疗领域亟待解决的重要问题。天然产物咖啡酸苯乙酯(Caffeic acid phenethyl ester,CAPE)是蜂胶中主要活性成分,具有抗氧化及抗肿瘤等多种生物学作用。有研究表明长链非编码RNAs(Long non-coding RNAs,LncRNAs)的表达与肿瘤的辐射敏感性相关,但基于lncRNAs调控的CAPE辐射增敏作用及机制尚不清楚。本研究以CAPE为研究材料,拟从lncRNAs层面揭示CAPE体外辐射增敏作用,并探索可能的调控机制。主要研究内容如下:1.CAPE对肝癌H22细胞的辐射增敏作用研究建立体外60Coγ辐射损伤H22细胞模型,通过检测细胞活力、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平和细胞凋亡情况研究CAPE体外辐射增敏作用。细胞活力检测指标显示,与单独60Coγ辐射(4Gy)对照组相比,CAPE结合辐射处理可有效抑制肝癌H22细胞增殖(P<0.001);此外,辐射处理能够显著增加H22细胞内ROS水平(P<0.001),而CAPE联合辐射处理后细胞内ROS水平更高(P<0.001);相应地,CAPE联合辐射处理后H22细胞凋亡率也显著提高(P<0.001)。综合细胞实验结果表明,CAPE对肝癌H22细胞具有显著的辐射增敏作用。2.CAPE诱导DElncRNAs的筛选及辐射增敏相关DElncRNAs的鉴定首先,采用高通量测序技术筛选CAPE诱导的差异表达lncRNAs(Differentially expressed lncRNAs,DElncRNAs);其次,利用 miRnada 软件预测候选DElncRNAs靶向miRNAs;最后,利用荧光定量PCR(quantitative realtime PCR,qRT-PCR)技术筛选参与CAPE辐射增敏过程中的关键DElncRNA。结果显示,CAPE能够诱导肝癌H22细胞中153个lncRNAs(65个lncRNAs上调,88个lncRNAs下调)表达产生显著性差异变化,qRT-PCR验证结果与测序结果一致;KEGG通路分析显示DElncRNAs共表达mRNAs主要参与肿瘤相关通路、DNA损失修复通路、细胞周期/凋亡通路和p53信号通路等;miRnada软件预测结果显示候选DElncRNAs与miR-200c-3p、miR-138-5p、miR-29b-3p、miR-101a-3p、miR-9-3p 和 miR-101a-5p 具有靶向结合位点;qRT-PCR结果显示,CAPE诱导候选DElncRNAs中核内小RNA宿主基因 8(small nucleolar RNA host gene 8,SNHG8)显著响应辐射处理(P<0.01),提示目标SNHG8可能为CAPE调控的潜在辐射增敏基因,值得进一步探究。3.目标SNHG8在CAPE辐射增敏过程中的作用及其功能保守性分析首先,构建低/过表达SNHG8的肝癌H22细胞株,通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)方法及qRT-PCR技术初步验证SNHG8在CAPEAlpelisib molecular weight辐射增敏过程中的作用;其次,利用BLASTn软件比对人及小鼠两物种基因组中SNHG8序列保守性;最后,在人肝癌HepG2细胞中验证SNHG8功能是否具有保守性。结果表明CAPE能够调控SNHG8在肝癌H22细胞中的表达,相应提高细胞辐射敏感性,说明SNHG8能够参与CAPE辐射增敏过程;此外,BLASTn 比对结果显示SNHG8序列在人与小鼠基因组中有短而高度保守的序列,提示SNHG8在人与小鼠两物种中可能具有相似的功能;最后,细胞活力实验显示SNH更多G8在人肝癌HepG2细胞中同样参与CAPE辐射增敏过程,且与H22细胞活力趋势相一致,表明SNHG8功能在人及小鼠两物种中具有保守性。4.基于SNHG8调控CAPE辐射增敏作用机制探索首先,利用双荧光素酶报告基因实验验证目标SNHG8与预测的靶向miR-29b-3p之间的结合关系;其次,利用TargetScan软件预测miR-29b-3p下游调控的靶基因,并验证预测结果;最后,通过细胞转染实验分别构建低/过表达SNHG8和低/过表达miR-29b-3p的H22细胞株,利用CCK-8、qRT-PCR及Western Blot等方法初步揭示CAPE调控SNHG8发挥辐射增敏作用的分子机制。结果表明CAPE诱导的SNHG8可以负向调控靶miR-29b-3p表达,相应减弱miR-29b-3p对Bcl-2表达的调控,影响凋亡相关蛋白Caspase 9、Caspase 3和Bak的表达,进而发挥辐射增敏作用。综上所述,CAPE对肝癌H22细胞具有显著的辐射增敏作用,其作用机制可能与其调控SNHG8/miR-29b-3p/Bcl-2轴,影响凋亡相关蛋白(Caspase 9、Caspase 3和Bak)的表达有关,这一研究可为天然产物作为辐射增敏剂的开发及应用提供一定的理论依据。