研究背景婴幼儿血管瘤又称血管瘤,是婴幼儿最常见的脉管异常性疾病。尽管血管瘤具有特殊的自限性病程,但仍有部分患儿因病灶局部破溃、压迫功能器官、可能遗留毁容性残迹等并发症而急需治疗。目前,血管瘤发病及自发消退的机制尚未探明。既往研究发现,表观遗传调控在血管瘤的发生、发展过程中发挥着重要作用。RNA的m6A甲基化修饰,即N6-腺苷酸甲基化修饰,是表观遗传调控的重要组成部分,可在不改变碱基序列的情况下实现转录后调控,影响RNA的代谢命运。m6A修饰是一种动态可逆的过程,这一过程需要甲基转移酶、去甲基化酶以及识别蛋白三类蛋白的共同参与。目前,关于血管瘤中m6A修饰的研究较为匮乏,m6A修饰在血管瘤中的分布及作用仍未探明,甲基转移酶KIAA1429在血管瘤中的表达及功能尚不清楚。研究目的探究增生期血管瘤中m6A甲基化修饰的分布,并对m6A修饰可能发挥的功能进行探索,初步绘制增生期血管瘤的m6A修饰图谱。明确KIAA1429在血管瘤中的表达及组织定位,并对其在血管瘤中的功能及作用机制进行进一步探索。研究方法在第一部分中,我们收集增生期血管瘤组织样本及瘤旁正常皮肤组织样本3对,利用 RNA 甲Barasertib纯度基化免疫共沉淀测序(Methylated RNA immunoprecipitation sequencing,MeRIP-seq)技术对增生期血管瘤组织及正常皮肤组织中的m6A修饰进行分析。两组组织的测序结果分别通过peak-calling软件及R包exomePeak进行m6A修饰peak的识别,统计peak在转录组上的分布;通过HOMER软件识别m6A修饰位点附近的典型序列(motif);并通过基因功能富集分析探究m6A修饰基因可能的作用。同时,对比增生期血管瘤组织及正常皮肤组织的测序结果,探究差异m6A修饰的分布;并通过基因功能富集分析探究差异m6A修饰基因可能的selleck化学作用。最后,结合MeRIP-seq与RNA测序(RNA sequencing,RNA-seq)进行关联性分析,寻找增生期血管瘤组织中发生差异m6A修饰且差异表达的基因,并通过基因功能富集分析探究这些基因可能的作用。在第二部分中,我们通过GEO数据库分析、qRT-PCR、western blotting及免疫组织化学染色明确血管瘤中KIAA1429的表达水平,通过免疫荧光染色明确KIAA1429在血管瘤组织中的定位。在进一步分离培养血管瘤内皮细胞(hemangioma endothelial cells,HemECs)后,我们通过多项体外实验探究KIAA1429对HemECs的作用,通过干细胞标志物表达水平的检测及成脂诱导分化实验探究KIAA1429对HemECs干性的影响,并对KIAA1429可能作用靶点的结合情况进行验证。此外,我们还通过药物干预实验探究普萘洛尔对HemECs中KIAA1429表达水平的影响。最后,我们通过构建血管瘤小鼠模型在体内明确KIAA1429对血管瘤的作用。研究结果本研究第一部分发现:1、增生期血管瘤组织及正常皮肤组织中的m6A修饰均主要发生于3’UTR及终止密码子附近,此外正常皮肤组织中的m6A修饰还多见于起始密码子附近;两组组织中可信度较高的m6A motif均包含GGACA;增生期血管瘤组织中的m6A修饰可能与组蛋白修饰、RNA剪接、核糖核蛋白复合物的发生及Notch信号通路相关,正常皮肤组织中的m6A修饰可能与组蛋白修饰及Wnt信号通路相关。2、相较于正常皮肤组织,增生期血管瘤组织中的差异m6A修饰多发生于3’UTR,差异m6A修饰基因以m6A修饰水平下调的基因为主,可能与组蛋白修饰、RNA剪接、肌动蛋白细胞骨架的调节、cGMP-PKG信号通路等相关。3、相较于正常皮肤组织,在增生期血管瘤组织里发生差异m6A修饰且差异表达的基因中,以m6A修饰水平下调且表达水平下调(Hypo-down)的基因为主,其次为m6A修饰水平下调而表达水平上调(Hypo-up)的基因,其中包括血管瘤标志物SLC2A1;Hypo-down基因可能与神经系统发育相关,Hypo-up 基因可能与细胞迁移相关。本研究第二部分发现:1、KIAA1429在增生期血管瘤组织中表达水平升高,且其表达水平随着血管瘤的消退进一步升高。2、KIAA1429在血管瘤中主要表达于HemECs,且其在HemECs中的表达水平高于其他血管内皮细胞及成纤Watch group antibiotics维细胞。3、体外实验发现,KIAA1429可抑制HemECs的增殖、迁移及侵袭能力,但不影响HemECs的凋亡水平;同时,KIAA1429可抑制HemECs的血管生成能力并下调内皮标志物的表达水平;相反地,KIAA1429可增强HemECs的贴壁能力并上调成纤维细胞相关分子的表达水平。4、进一步对KIAA1429的作用机制进行探究发现,KIAA1429可促进HemECs向兼性干细胞转变,增强HemECs的分化能力,上调HemECs中干细胞标志物表达水平及GLUT1表达水平,且其对GLUT1表达水平的影响不依赖于m6A修饰。5、药物干预实验发现,普萘洛尔可上调HemECs中KIAA1429的表达水平。6、动物实验发现KIAA1429可体内促进血管瘤的消退。研究结论本研究发现增生期血管瘤组织中的m6A修饰多发生于3’UTR及终止密码子附近;相较于正常皮肤组织,增生期血管瘤组织中较多基因发生m6A修饰水平的下调,其中Hypo-down基因可能与神经系统发育相关,Hypo-up基因可能与细胞迁移相关。甲基转移酶KIAA1429在血管瘤中高表达,其主要表达于HemECs,可增强HemECs的干性、抑制HemECs的内皮表型并促进HemECs获得成纤维细胞样表型,发挥促进血管瘤消退的作用。