背景:孢子丝菌病(Sporotrichosis)是一种全球广泛分布的由孢子丝菌复合体(Sporothrix complex)引起的累及皮肤、皮下组织、粘膜及局部淋巴系统的慢性感染性疾病,可播散至全身,引起系统性损害。我国是人孢子丝菌病的高发国家,尤其是东北地区,孢子丝菌病是一个比较严重公共卫生问题。目前,孢子丝菌病临床治疗手段仍然很有限,主要包括免疫调节剂碘化钾和各类抗真菌药物,治疗既耗时又昂贵,且患者主要分布在农村地区,治疗存在较PS-341半抑制浓度高的经济成本和时间成本。因此,深入研究孢子丝菌病的发生发展机制,探索新的可靠有效的治疗靶点,是当前该研究领域的热点和亟待解决的关键问题。转录组学测序在RNA水平研究基因表达的情况,发现在细胞或组织内异常表达的mRNA、lncRNA和miRNA,并可对编码和非编码基因间的互作网络进行分析,有助于深入理解疾病的病理生理机制,是探索疾病发生发展及开发诊断治疗靶点的重要研究方法。在本研究中,我们通过全转录组学测序,发现在孢子丝菌病患者皮损组织中异常表达的lncRNA有671个,mRNA有3281个,miRNA有214个,使用Cytoscape软件构建ceRNA网络,确定了核心lncRNA、miRNA和mRNA分子。此外,进行GSEA基因富集分析,发现多个信号通路相关基因在孢子丝菌病患者皮损组织中富集,包括Toll样受体信号通路、NK细胞介导的细胞毒作用、T细胞受体信号通路、NOD样受体信号通路和JAK/STAT信号通路。其中,JAK/STAT信号通路在孢子丝菌Bio-mathematical models病患者皮损组织中明显富集,我们利用RT-qPCR和Western Blot实验,验证JAK/STAT信号通路相关基因在孢子丝菌病患者皮损组织中的表达情况,结果显示在孢子丝菌病患者皮损组织中SOCS3、IL-6、JAK3、p-JAK3和STAT3、p-STAT3蛋白表达水平显著升高。最后,应用免疫组织化学方法进一步验证孢子丝菌病患者皮损组织中JAK3及其磷酸化蛋白的表达情况,分析JAK3表达与疾病临床特征的相关性,结果表明,JAK3及其磷酸化蛋白在孢子丝菌患者皮损组织中表达显著高于正常皮肤,且在淋巴管型中表达更为明显。综上所述,本研究通过全转录组学测序,对孢子丝菌病患者皮损组织样本进行检测分析发现与孢子丝菌病相关的mRNA、lncRNA和miRNA,以及多个ceRNA调控网络,并进一步结合临床样本检测,验证JAK/STAT信号通路在孢子丝菌病患者皮损组织中显著激活,提示JAK/STAT信号通路可能参与调控孢子丝菌病的发生发展过程,为进一步探究孢子丝菌病的发生发展机制和开发新的治疗靶点提供了理论基础和数据支持。方法:1.收集孢子丝菌病患者的皮损组织,以皮肤外科整形患者重眼睑术中切取的正常皮肤组织为对照,用Trizol提取组织内总RNA,分别构建长链RNA转录组文库和miRNA转录组文库并进行全转录组测序。2.对测序原始数据进行质量预处理和数据过滤后,先用主成分分析(principal component analysis,PCA)进行样本间的比较,然后使用DEseq2方法以|log2FC|≥1、矫正P值<0.05为阈值作为筛选条件筛选差异表达基因。3.对筛选得到的差异表达基因(包括lncRNA、mRNA和miRNA)进行GO预测(Gene Ontology)、KEGG分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)以及GSEA基因富集分析(Gene Set Enrichment Analysis),分析与孢子丝菌病发生发展相关的关键基因和主要信号通路。4.对于转录组测序发现的异常表达lncRNA,我们利用miRcode/lnc Base两个数据库通过分析预测其靶miRNA,再使用RNAHybrid/miRTar Base/Target Scan三个数据库分析得到差异miRNA的靶基因mRNA。最后通过得到的异常表达lncRNA-交集miRNA-交集mRNA,使用Cytoscape软件构建ceRNA网络,确定在孢子丝菌病中异常表达的核心lncRNA、miRNA和mRNA分子。5.选取DKK1、ACTG2、JAK3和SLC7A11四个差异基因。经RT-qPCR在孢子丝菌病患者皮损组织和健康正常皮肤对照组织中进行表达验证,验证测序结果。6.选取在孢子丝菌病中显著富集的JAK/STAT信号通路作为研究对象,利用RT-qPCR检测该通路相关基因IL-6、JAK3、SOCS3和STAT3在孢子丝菌病患者皮损组织和健康正常对照组织中的表达情况。进一步通过Western Blot检测JAK/STAT信号通路中IL-6、SOCS3、JAK3和STAT3的表达情况和磷酸化水平,明确JAK/STAT信号通路在孢子丝菌病患者皮损组织中的激活情况。7.通过免疫组化检测孢子丝菌病患者皮损组织中JAK3及其磷酸化蛋白的表达情况,分析JAK3及其磷酸化蛋白的表达与疾病临床特征的相关性,进一步探讨JAK3在孢子丝菌病发生发展中的作用。结果:1.共收集了15例患者(男性5名,女性10名)皮损组织样本和5例(男性2名,女性3名)健康正常对照皮肤组织样本,其中5例病例样本和3例对照样本用于全转录组测序。长链RNA测序一共检测到123185个基因,其中mRNA18561个,lncRNA 51706个,circ RNA 45866个。miRNA测序一共检测到1939个基因。2.PCA分析结果表明,孢子丝菌病患者皮损组织与健康正常对照组织中lncRNA、mRNA和miRNA表达谱存在显著差异。进一步分析结果显示,在孢子丝菌病患者皮损组织中表达水平显著异常的lncRNA总数为671RSL3生产商个,其中有392个表达水平升高,279个降低;mRNA总数为3281个,其中有1693个表达水平升高,1588个降低;miRNA总数为214个,其中有99个表达水平升高,115个降低。3.GO预测发现,在孢子丝菌病皮损组织中表达水平显著降低的mRNA主要参与cell matrix adhesion、neural crest cell migration、Wnt signaling pathway等生物学过程,参与构成node of Ranvier、receptor complex、cytoskeleton等细胞组分,行使sequence-specific DNA binding、growth factor binding、nitric-oxide synthase binding等分子功能;而表达水平显著升高的mRNA主要参与B cell receptor signaling pathway、T cell receptor signaling pathway、chemokine-mediated signaling pathway等生物学过程,参与构成lysosome、MHC class I protein complex、tertiary granule lumen等细胞成分,具有NAD+nucleosidase activity、C-C chemokine receptor activity、non-membrane spanning protein tyrosine kinase activity等分子功能。KEGG分析结果表明在孢子丝菌病皮损组织中表达水平降低的mRNA主要参与c AMP signaling pathway、Hippo signaling pathway、TGF-beta signaling pathway和Wnt signaling pathway等信号通路,而表达水平升高的mRNA主要参与NOD-like receptor signaling pathway、Natural killer cell mediated cytotoxicity、Antigen processing and presentation和NF-kappa B signaling pathway等;在人类疾病分类中主要是与Infectious disease、Immune disease等有关,在宿主系统中主要是与Immune system、Endocrine system以及Digestive system有关;表达水平降低的miRNA主要参与c AMP signaling pathway、Primary immunodeficiency、HIF-1 signaling pathway以及Peroxisome等,表达水平升高的miRNA主要参与Lysosome、Primary immunodeficiency、p53 signaling pathway和PI3K-Akt signaling pathway等;在人类疾病分类中主要是与Infectious disease、Immune disease等有关,在宿主系统中主要是与Immune system、Endocrine system以及Sensory system有关。GSEA富集分析结果表明在孢子丝菌病皮损组织中表达异常的mRNA主要富集在Natural killer cell mediated cytotoxicity、Antigen processing and presentation、Primary immunodeficiency、Toll-like receptor signaling pathway、T cell receptor signaling pathway、NOD-like receptor signaling pathway、Apoptosis、JAK/STAT signaling pathway等信号通路。4.将异常表达miRNA靶向的mRNA与异常表达的mRNA取交集,对得到的mRNA进行KEGG分析,结果显示交集mRNA主要参与JAK/STAT signaling pathway、TNF signaling pathway以及Phagosome等信号通路调控。ceRNA网络分析表明核心lncRNA有LOC105374338、LOC105370792、URS0001BCE66F等,核心miRNA有miR-143-5p、miR-20b-5p、miR-31-5p、miR-1268a等,核心mRNA有JAK3、SLC4A1、ESR1、GAMT等。5.选取13例临床样本,其中孢子丝菌病患者皮损组织8例,健康正常皮肤对照组织5例。用Trizol提取组织mRNA,进行RT-qPCR检测DKK1、ACTG2、JAK3和SLC7A11的表达水平。结果显示,与健康正常皮肤对照组相比,在孢子丝菌病患者皮损组织中DKK1和ACTG2的表达水平显著降低,JAK3和SLC7A11的表达水平显著升高,这与全转录组学测序结果完全一致。6.提取8例孢子丝菌病患者皮损组织与5例健康正常皮肤对照组织的mRNA和总蛋白质,利用Western Blot和RT-qPCR实验检测JAK/STAT信号通路相关蛋白的表达情况。结果显示,在孢子丝菌病患者皮损组织中,SOCS3、IL-6和JAK3的mRNA表达水平显著高于健康对照组织,而STAT3的mRNA表达水平则没有明显变化;Western Blot实验发现SOCS3、IL-6、JAK3和STAT3蛋白在皮损组织中表达水平显著高于对照组织,JAK3和STAT3磷酸化水平也明显高于对照组织,说明JAK/STAT信号通路在孢子丝菌病患者皮损组织中显著激活。7.收集30例孢子丝菌病患者皮损组织的石蜡切片,9例健康正常皮肤组织石蜡切片,通过免疫组织化学技术检测JAK3及其磷酸化蛋白在两组皮肤组织中的表达情况,结果发现JAK3及其磷酸化蛋白在孢子丝菌病患者皮损组织中表达水平显著高于健康正常皮肤对照组织,且在淋巴管型患者皮损中的表达水平显著高于固定型,但与病程无显著相关性。结论:1.孢子丝菌病患者皮损组织与健康正常皮肤组织的转录谱明显不同,其中在孢子丝菌病患者皮损组织中表达水平显著异常的lncRNA有671个,mRNA有3281个,miRNA有214个。2.在孢子丝菌病患者皮损组织中表达水平显著异常的基因与感染性疾病及免疫反应相关疾病有关,主要的相关信号通路包括Toll样受体信号通路、NK细胞介导的细胞毒作用、T细胞受体信号通路、NOD样受体信号通路和JAK/STAT信号通路。本研究构建了孢子丝菌病ceRNA调控网络关系,获得核心mRNA(JAK3、SLC4A1、ESR1、GAMT)、核心lncRNA(LOC105374338、LOC105370792、URS0001BCE66F)以及核心miRNA(miR-143-5p、miR-20b-5p、miR-31-5p、miR-1268a)。3.在mRNA和蛋白质表达水平上对JAK/STAT信号通路相关分子进行验证,孢子丝菌病患者皮损组织中SOCS3、IL-6和JAK3的mRNA表达水平显著升高,SOCS3、IL-6、JAK3和STAT3蛋白表达显著上调,JAK3和STAT3蛋白磷酸化水平也明显高于健康正常对照皮肤组织。明确JAK/STAT信号通路在孢子丝菌病皮损组织中显著激活,提示其可能参与孢子丝菌病的发生发展过程。4.孢子丝菌病患者皮损组织中JAK3及其磷酸化蛋白表达量较健康正常皮肤对照组显著升高,且淋巴管型患者皮损组织中JAK3和p-JAK3的表达水平明显高于固定型,进一步证明了JAK3作为关键分子参与了孢子丝菌病发生发展,且在淋巴管型中更为活跃。