镰刀菌广泛存在于自然界,是重要的植物病原菌和人类机会致病菌。在农业上可以感染玉米、小麦、香蕉等农作物,造成经济损失。在临床上主要造成角膜、皮肤等浅部感染,在免疫缺陷患者中,可以引起侵袭性感染,其致死率高达43-67%。另一方面,镰刀菌具有天然多重耐药性,对大部分常用的抗真菌药物敏感性较低,限制了其治疗效果。(1)假定蛋白FoDbp40调控尖孢镰刀菌生长和毒力真菌的毒力与生长之间存在密切的联系。在白假丝酵母、烟曲霉等多种真菌中,基因突变或缺陷导致生长受限后,毒力会随之下降。在镰刀菌中,生长与毒力之间的研究报道较少。观察镰刀菌的生长性状,筛选调控生长的关键基因,分析其基因功能,有助于为抗真菌的药物的研发提供新的靶标。能量代谢通过影响PKA、AMPK等通路,对生长和毒力具有一定的调控作用。其中PKA通路的作用在白假丝酵母、烟曲霉、镰刀菌等真菌中已经有大量报道,而能量代谢通过AMPK通路影响生长和毒力的作用仅在酿酒酵母中有初步研究。真菌的能量代谢除了葡萄糖的糖酵解和TCA循环外,还依赖于乙醛酸循环通路。乙醛酸循环通路可以在节约碳源的前提下,生成一定量的ATP,其对生长与毒力的调控作用在酵母属真菌中已有初步研究,在镰selleck Entinostat刀菌中报道较少。课题组前期工作中,通过农杆菌介导的遗传转化(Agrobacterium tumefaciensmediated transformation,ATMT)技术获得一株生长显著减慢的尖孢镰刀菌突变体FOM312。经TAIL-PCR验证,该突变体中T-DNA打断基因为FOXG＿12762,编码假定蛋白。经序列比对分析,其含有CCCH锌指蛋白结构域和核定位信号,在少数几种真菌中的同源蛋白注释为含CCCH锌指结构域的DNA结合蛋白。考虑到已报道的多种锌指蛋白均在细胞核中发挥转录调控作用,推测该假定蛋白可能为具有转录调控作用的DNA结合蛋白,暂命名为FoDbp40。FOM312中,乙醛酸循环通路的相关基因表达量和ATP水平均下降,其中限速酶异柠檬酸裂合酶(ICL)的表达下降幅度最大,可能对其生长减慢起一定的调控作用。构建FOXG＿12762的敲除株和回复株,对其ICL表达及活性水平进行检测。结果显示,在敲除株中,ICL的表达水平下降,其产物琥珀酸的水平及ATP的水平下降,说明ICL的表达与活性可能受到FoDbp40的影响。观察FoDbp40-EGFP的荧光定位,确定了FoDbp40位于细胞核。利用双荧光素报告酶系统分析FoDbp40与ICLiproxstatin-1分子量L启动子区的互作,结果显示,FoDbp40可以促进ICL启动子下游基因转录表达,因此可能对ICL的转录起到调控作用。FoDbp40缺陷后,尖孢镰刀菌的ATP水平和AMPK/m TOR通路活性均受影响。将尖孢镰刀菌与人角膜上皮细胞(HCEC)共培养,观察细胞活力和炎症因子表达水平。结果显示,FoDbp40缺陷导致了对HCEC细胞毒力和诱导炎症水平的降低。将尖孢镰刀菌与斑马鱼共培养,观察斑马鱼的生存率,结果显示,FoDbp40的缺失导致了对斑马鱼毒力的降低。(2)核黄素代谢通路调控尖孢镰刀菌的耐药性唑类药物种类多,应用范围广,临床上常用于真菌感染的治疗,其作用机制主要是通过抑制麦角甾醇合成途径中的甾醇14α-去甲基化酶(sterol14-demethylase,cytochrome P450 family 51,CYP51),干扰麦角甾醇的合成,导致细胞膜稳定性下降,杀伤细胞。核黄素代谢的产物黄素单核苷酸(flavin mononucleotide,FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)等辅酶与多种细胞功能相关,包括氧化还原、能量代谢等,二者参与调节CYP51的活性,但其与真菌耐药的联系目前报道较少。选择尖孢镰刀菌核黄素代谢通路中的关键基因进行敲除,并对敲除株进行药敏试验,结果显示,编码核黄素激酶的FOXG＿03172的缺陷会导致其对伏立康唑的敏感性上升。构建FOXG＿03172回复株,其药物敏感性恢复到与野生型尖孢镰刀菌相同水平。检测核黄素激酶产物水平、电子传递相关蛋白与CYP51的表达水平及产物水平,结果显示,FOXG＿03172缺陷导致其产物FMN辅酶减少,NADPH细胞色素P450氧化还原酶2(NADPH-dependent cytochrome P450 oxidoreductase 2,CPR2)hepatitis and other GI infections和CYP51A表达下降,麦角甾醇水平降低。综上所述,尖孢镰刀菌中,ICL对能量水平具有调控作用。假定蛋白FoDbp40可在转录水平上调节ICL的表达与活性,影响能量代谢及AMPK/m TOR通路,调控其生长和毒力,FoDbp40和ICL有望成为新的抗真菌药物靶标。核黄素代谢通路中的核黄素激酶可通过调节FMN的合成,调控CPR2和CYP51A的表达及麦角甾醇的合成,影响尖孢镰刀菌对唑类药物的耐药性。核黄素激酶和CPR2具有成为药物靶点的潜力。