研究背景心血管疾病是全球范围导致患者死亡的主要原因,而动脉粥样硬化是大部分心血管疾病进展的基础,因此深入研究动脉粥样硬化发生发展的生物学机制,对动脉粥样硬化相关疾病的防治具有重要意义。E1A激活基因阻遏子1(cellular repressor of E1A stimulated genes 1,CREG1)能够调控细胞增殖、分化和衰老,在血管损伤重构的生物学进程中具有重要作用。前期研究发现在动脉粥样硬化形成过程中CREG1表达下降,外源添加CREG1具有抗动脉粥样硬化作用。巨噬细胞吞噬氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,OX-LDL)转化为泡沫细胞是动脉粥样硬化发生发展的核心环节,巨噬细胞对OX-LDL吞噬和代谢与清道夫受体A(scavenger receptor class A member 1,SRA)和溶酶体密切相关。因此本研究对CREG1的抗动脉粥样硬化作用进行了深入研究,并且将CREG1对SRA和溶酶体功能的调控作为研究重点,发掘CREG1对巨噬细胞转化为泡沫细胞这一生物学进程的调控机制,为动脉粥样硬化防治提供新的干预靶点。研究目的1、明确巨噬细胞中CREG1水平对动脉粥样硬化的发生发展是否具有调控作用。2、探究在动脉粥样硬化微环境中巨噬细胞CREG1水平如何影响巨噬细胞向泡沫细胞转化。3、阐明CREG1对影响巨噬细胞向泡沫细胞转化的关键分子SRA是如何调控的。研究方法1、通过应用载脂蛋白E缺乏(apolipoprotein E-deficient,Apo E~(-/-))小鼠给予西方饮食(Western diet,WD)喂养构建动脉粥样硬化模型。应用蛋白免疫印迹(Western blot,WB),实时定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测各组织中CREG1水平。2、应用Apo E~(-/-)背景CREG1巨噬细胞特敲小鼠(Apo E~(-/-)CREG1~(fl/fl)Lyz2~(cre))给予WD喂养构建动脉粥样硬化模型。应用油红O染色检测小鼠主动脉及主动脉根部动脉粥样硬化程度。应用免疫荧光染色检测主动脉根部动脉粥样硬化斑块中SRA的水平。应用WB、q RT-PCR检测动脉粥样硬化斑块中相关蛋白的表达水平。3、提取Apo E~(-/-)背景CREG1巨噬细胞特敲小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone-marrow-derived macrophage,BMDM),给予OX-LDL刺激。应用油红O染色检测泡沫细胞形成情况。应用荧光标记乙酰化低密度脂蛋,检测SRA介导的吞噬水平。应用WB、q RT-PCR检测相关蛋白的表此网站达水平。4、应用Apo E~(-/-)背景小鼠注射CREG1巨噬细胞特异过表达腺病毒(adeno-associated virus-F4/80-CREG1,AAV-F4/80-CREG1),之后给予WD喂养构建动脉粥样硬化模型。应用油红O染色检测小鼠主动脉及主动脉根部动脉粥样硬化程度。应用免疫荧光染色检测主动脉根部动脉粥样硬化斑块中SRA的水平。应用WB、q RT-PCR检测动脉粥样硬化斑块中相关蛋白的表达水平。5、提取Apo E~(-/-)背景CREG1巨噬细胞特异过表达小鼠(AAV-F4/80-CREG1)BMDM,给予OX-LDL刺激。应用油红O染色检测泡沫细胞形成情况。应用荧光标记乙酰化低密度脂蛋,检测SRA介导的吞噬水平。应用WB、q RT-PCR检测相关蛋白的表达水平。6、应用小鼠巨噬细胞细胞系转染CREG1小干扰RNA及SRA小干扰RNA,实现巨噬细胞敲低CREG1、SRA,给予OX-LDL刺激。应用油红O染色检测泡沫细胞形成情况。7、应用小鼠巨噬细胞细胞系转染CREG1质粒及SRA质粒实现巨噬细胞过表达CREG1、SRA,给予OX-LDL刺激。应用油红O染色检测泡沫细胞in vivo biocompatibility形成情况。8、应用小鼠巨噬细胞细胞系转染CREG1质粒,在OX-LDL刺激下分别给予蛋白质合成抑制剂,蛋白酶体降解抑制剂,溶酶体降解抑制剂,应用WB检测相关蛋白的表达水平。9、应用小鼠巨噬细胞细胞系转染CREG1质粒,在OX-LDL刺激后,应用溶酶体标记染料检测溶酶体酸化程度。研究结果1、在体研究结果显示,在动脉粥样硬化斑块中CREG1表达下降,Apo E~(-/-)背景CREG1巨噬细胞特敲小鼠WD诱导的动脉粥样硬化程度明显加重,动脉粥样硬化斑块中SRA水平增加。离体研究结果显示在动脉粥样硬化微环境中巨噬细胞CREG1缺乏导致SRA水平升高,泡沫细胞形成增加,SRA介导的吞噬增加。2、在体研究结果显示,Apo E~(-/-)背景CREG1巨噬细胞特异过表达小鼠WD诱导的动脉粥样硬化程度明显减轻,动脉粥样硬化斑块中SRA水平减少。离体研究结果显示在动脉粥样硬化微环境中巨噬细胞CREGAngiogenesis抑制剂1过表达导致SRA水平降低,泡沫细胞形成减少,SRA介导的吞噬减少。3、离体研究结果显示,敲低SRA导致巨噬细胞CREG1缺乏所致的泡沫细胞形成增加被抑制,过表达SRA导致巨噬细胞CREG1过表达所致的泡沫细胞形成减少被抑制。4、离体研究结果显示,CREG1不影响SRA的转录及翻译过程,但能够增加SRA的降解,且主要通过增强溶酶体功能增加SRA降解。结论巨噬细胞中CREG1水平与动脉粥样硬化的发生发展密切相关。在动脉粥样硬化微环境中巨噬细胞CREG1能够通过溶酶体增加SRA的降解,减少巨噬细胞对OX-LDL的吞噬,抑制泡沫细胞的形成,减轻动脉粥样硬化。