衰老是不可逆的过程,衰老被认为是导致组织和器官功能随年龄增长而衰退的原因,它还与年龄相关疾病的发展有关,如神经衰退性疾病、阿尔兹海默症、心血管疾病、糖尿病和癌症。因此衰老已成为现代医学研究的热点,大多对衰老的机制集中于氧化应激自由基学说、炎症引发衰老、免疫衰老、肠道菌群失调等。体内氧化应激导致自由基大量堆积,细胞功能衰退和增殖,导致细胞损伤和死亡增加。同时,促炎性细胞因子增多导致的长期慢性炎症反应,免疫系统功能逐渐下降多种疾病的发生,炎性衰老和免疫功能的失调与肠道菌群的变化有密切联系。因此衰老并不是单一机制作用的结果,针对这些机制理论的延缓衰老的药物和天然产品的开发也成为研究热点。目的:由于对天然、安全抗衰物质的需求。从陕西和四川传统发酵食品浆水、泡菜以及实验室保存的从粪便中分离的乳酸菌中筛选出具有强氧化性的乳酸菌,并对其生理特性、安全性进行评估。同时,选取六味先前研究有抗氧化成分的中药通过体外中药和乳酸菌共培养实验,确定对乳酸菌无抑制作用或促进其生长且有抗氧化效果的中药,旨在探究中药联合乳酸菌在体内能否协同增强抗氧化效果。用D-半乳糖构建衰老小鼠模型,给与小鼠中药、乳酸菌、中药联合乳酸菌治疗,判断单独用药和联合用药治疗策略上抗衰老、免疫效果的差异,探究是否中药联合益生菌有协同作用,并对各组小鼠肠道菌群进行测定,观察实验对正常组小鼠、衰老小鼠及各治疗组小鼠对肠道菌的影响。方法:(1)实验菌的筛选:首先对发酵食品原液进行梯度稀释涂板分离出单克隆菌株,再次分纯划线,并且在溴甲酚紫培养基上挑选出产酸的菌落,同时满足革兰染色镜检为革兰阳性菌的菌株,保菌进行后续DPPH清除实验、羟基清除实验、亚铁离子螯合实验、超氧阴离子清除实验、过氧化氢耐受实验等抗氧化性实验。对筛选出的强抗氧化菌进行生理特性实验:疏水性实验、自聚集实验,体外判断其肠道粘附力。之后对筛选出的菌株进行16Sr RNA对菌株种属进行鉴定和安全性评估:溶血实验、MIC耐药实验、和毒力基因的测定。最后通过菌株对过氧化氢损伤细胞的保护性实验和tibio-talar offset抑菌实验来评估其抗氧化性能及益生性。(2)有抗氧化性的中药体外对益生菌生长影响:选取甘草、白术、桑葚、覆盆子、黄芪、五味子六味中药,以饮片浓度为5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL的中药浓度添加至MRS培养基,厌氧环境下培养24 h,以MRS培养基的乳酸菌培养液为对照,判断中药体外对益生菌生长的影响,选取最适合的中药用于体内实验。(3)益生菌与中药抗氧化能力的体内实验:D半乳糖以100 mg/kg,0.3 m L颈背部皮下注射C57BL/6J小鼠,连续6周制备衰老模型,阴性对照组(Neg Con)每天皮下注射和灌胃0.9%Na Cl溶液分别为0.3 m L、0.2 m L。中药组(TCM)、菌组(J2-5,9)、中药联合菌组(TCM+J2-5,9)分别灌胃中药溶液、菌悬液、中药+菌悬液,中药浓度为2.0 g/kg,0.3 m L,菌悬液浓度为2×10~9 CFU。期间每周称量体重。造模及治疗时间结束后,解剖取材,计算内脏比重,测量肝脏SOD、POD、MDA、CAT的含量。脾脏提取RNA,逆转录为c DNA后,荧光定量PCR检测IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ相对含量。对结肠切片组织进行HE染色,判断D-半乳糖造模导致炎性衰老对肠组织损伤程度。(4)从结肠中取得的五组小鼠的粪便,进行高通量16S r RNA测序。观察衰老对肠道菌群的分布影响,以及乳酸菌、中药、中药联合乳酸菌治疗后的菌群变化。结果:(1)通过抗氧化实验筛选出J2-4、J2-5、J2-9、YP-1、W-4五株菌,疏水性分别为23.07±1.38%,93.53±1.15%,85.42±0.80%,79.86±0.90%,82.12±0.65%。自凝集率为90.13±0.43%,90.37±0.44%,92.42±0.35%,82.87±0.1%,90.5±0.187%。16S r RNA结果表明J2-4、J2-5、J2-9为发酵乳杆菌,YP-1、W-4为副干酪乳杆菌。在MIC试验中,发酵乳杆菌J2-4、J2-5和J2-9对多肽和四环素类抗生素表现出中度耐药性,而副干酪乳杆菌YP-1和W-4对β-类酰胺和多肽类抗生素表现出耐药性。所有菌株均对氯霉素和氨基糖苷类药物敏感。溶血实验表明发酵乳杆菌J2-4、J2-5、J2-9为γ-溶血性活性(非溶血),而副干酪乳杆菌(粪便中的W-4和泡菜中的YP-1)呈现暗绿色(α-溶血)。抑菌实验表明,J2-5、J2-9对鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌有一定的抑制作用,由于J2-4的疏水性和抗菌活性较弱,最后MK-1775小鼠我们选择J2-5、J2-9进行细胞实验,J2-5和J2-9通过增加过氧化氢损伤的293T细胞的SOD、CAT、T-AOC活性,表现出良好的抗氧化损伤能力。最终选J2-5、J2-9为灌胃菌。(2)五类中药,除桑葚外均对J2-5,J2-9有不同程度抑制作用。(3)在肝脏自由基与抗氧化酶的检测中,与衰老组相比菌组、中药联合菌组SOD活力差异显著,中药组无统计学意义;中药组、菌组及菌联合中药组的MDA与衰老组差异显著,P值分别为0.0227,0.0028,0.0048,尤其菌组J2-5,9组的MDA最低;各治疗组的POD值显示统计学无明显差异,中药组的POD活力均值较低,菌组LGX818小鼠均值相对最高;菌组肝脏CAT含量升高与其他组差异显著。q PCR检测脾脏促炎因子、抗炎因子:衰老组的IL-2含量高于其他三组治疗组,中药组无明显差异,菌组(P<0.0001)和中药联合菌组(P=0.0096)降低该促炎因子显著;治疗组的IL-6水平高于衰老组,菌组和中药联合菌组与造模组比有明显差异;菌组、中药组和中药菌联合组均显示有显著上调IL-4的作用;同样三组治疗组能刺激IL-10的分泌;菌组的IFN-γ含量增加。小鼠结肠HE染色表明,衰老组的结肠组织有炎性细胞浸润,三组治疗组对炎症及损伤有缓解作用,尤其菌组。(4)在对肠道菌群的高通量测序后,与衰老模型组相比治疗组的Alpha多样性丰度明显增高,尤其是菌J2-5,9组。衰老组及不同治疗组处理后小鼠的肠道菌群丰度发生了不同的变化。结论:(1)通过体外抗氧化实验、体外定植能力测定实验、安全性实验等筛选的发酵乳杆菌J2-5,J2-9可用于食品药物等方向。(2)在动物体内实验中显示单独灌胃菌组表现出最强的抗衰老功效,中药联合菌组抗氧化效果略低于菌组,中药组最低效果不佳。(3)菌组在肠道菌群丰富度说明益生菌J2-5,9在体内发挥了强的抗氧化功能,并且改善肠道菌群的丰富度。综合结果,单独灌胃益生菌J2-5,9表现出最强的治疗效果,改善衰老带来的炎症,改善、丰富肠道菌群等,中药桑葚联合菌组效果略低于单独用菌组,中药桑葚组效果不佳。后续应对中药梯度进行探索,观察是否是浓度影响。