目的 原核表达纯化重组蛋白GP900，初步探究微小隐孢子虫微线体蛋白GP900通过NF-κB/MAPK信号通路对RAW264.7细胞的免疫调节作用。方法 微小隐孢子虫GP900蛋白的氨基酸序列经在线网站ExPASy、SOPMA预测其的理化性质和二级结构；通过DNAStar软件和SYFPEITHI在线服务器预测GP900蛋白的B细胞及T细胞优势抗原表位，筛选获得最佳GP900重组蛋白氨基酸位置。以微小隐孢子虫卵囊cDNA为模板，PCR扩增GP900基因片段，构建pET-32a-GP900重组质粒并转化到BL21感受态细胞中诱导表达。重组蛋白经纯化、超滤浓缩并去内毒素。采用不同浓度的GP900重组蛋白刺激RAW264.7细胞24 h后，检测其对巨噬细胞的活力。以LPS(1μg/ml)为阳性对照，通过流式细胞术检测CD86表达量；通过RT-PCR和ELISA检测RAW264.7细胞中IL-6和TNF-ɑ表达量；采用Western blotting实验检测NF-κB和MAPK信号通路中P65蛋白和ERK蛋白磷酸化水平。结果生物信息学分析发现，当GP900蛋白的氨基酸位置位于871-1070时，重组蛋白为稳定的亲水性蛋白，二级结构中β转角和无规则卷曲的占比较高且含有较丰富的T、B细胞抗原表位。表达的重组蛋白GP900871-1070分子质量与理论值相符。CCK8结果显示重组蛋白GP900871-1070对细胞没有毒性作用，后续作用浓度选择0.16μg/ml、0.8μg/ml和4μg/ml。流式细胞术结果显示，CD86的表达量分别为13.500±0.815,18.670±0.657,20.470±1.271，后两者均高于空白对照组14.500±0.872 (t=3.818、3.872，均P <0.05)。RT-PCR结果显示，3个浓度梯度组巨噬细胞的IL-6 mRNA相对转录水平分别为1.409±0.050,2.052±0.098,3.284±0.097，三者均高于空白对照组1.010±0.096(t=3.700,7.5IDN-655695,16.700，均P <0.05);3个浓度梯度组巨噬细胞的TNF-ɑmRNA相对转录水平分别为1.077±0.034,1.440±0.021,2.378±0.037，后两者均高于空白对照组1.000±0.025 (t=13.380,30.850，均P <0.01)。ELISA检测结果显示，巨噬细胞培养上清中，3个浓度梯度组IL-6细胞因子的表达量分别为535.400±17.230,572.80capsule biosynthesis gene0±8.286, 555.600±23.940，三者均高于空白对照组454.400±18.630 (t=3.193, 5.809, 3.339，均P <0.05);3个浓度梯度组TNF-ɑ细胞因子的表达量分别为351.800±12.270,386.400±10.250,489.800±10.540，后两者均高于空白对照组324.200±11.070 (t=4.125,10.830，均P <0.01)。Western blotting结果显示，3个浓度梯度组巨噬细胞的p-P65蛋白和p-ERK蛋白相对表达量分别为2.294±0.254,1.714±0.205,1.877±0.309,1.522±0.054,1.760±0.Lapatinib化学结构066,1.582±0.027，三者均高于空白对照组1.0±0.0 (t=5.100,3.489,2.836,9.737,11.450,21.900，均P <0.05)。结论 不同浓度GP900871-1070重组蛋白刺激巨噬细胞后，通过激活NF-κB和MAPK信号通路诱导RAW264.7细胞活化,通过促进TNF-α和IL-6 mRNA的转录参与巨噬细胞的免疫调节，促进宿主防御寄生虫的感染。