背景:肺结核(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染引起的传染病,是单一感染源致死的第二大病因,近年来,耐药结核分枝杆菌的出现和传播进一步增加了结核病的防治难度。此外,结核病的治疗周期长、患者服从性差,加剧了耐药结核病的发展。因此,抗结核新靶点的发现、新药物的开发以及抗结核策略优化对于结核病的诊疗至关重要。我国拥有丰富的中医药资源和悠久的中医药文化,积累了丰富的用药知识,临床使用十分普遍。随着中医药研究的深入,其作用机制日渐清晰。天然产物来源广泛,包括中草药、动物和微生物来源的化学成分或其代谢物,结构丰富,药理作用众多,使其在临床药物开发中脱颖而出。本研究从三个重要抗结核靶标酶入手,构建酶活性抑制剂高通量、可视化荧光筛选体系,期望从天然产物中发掘新的抗结核药物,优化治疗方案。N-乙酰转移酶2(N-acetyltransferase,NAT2)可以将一线抗结核药物异烟肼代谢为乙酰异烟肼,在Mtb中参与分枝菌酸的合成和异烟肼的代谢失活。将NAT2作为抗selleck抑制剂结核靶点,建立一种NAT2活性高通量、可视化的检测方法,筛选天然产物来源的抑制剂。既可以通过抑制分枝菌酸的合成发挥抗菌作用,又可以减少异烟肼的代谢失活,通过联合用药增强抗结核的效果。β-内酰胺酶(β-lactamase,Blac)是结核分枝杆菌对β-内酰胺类抗生素耐药的根本原因,它可以破坏抗生素的β-内酰胺环,使其失去抗菌作用。通过荧光可视化酶活性筛选平台评价Blac的天然来源抑制剂,逆转结核分枝杆菌对β-内酰胺类抗生素的天然耐药性,探究抗结核治疗新方案。硫氧还蛋白系统由硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TrxR)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸组成,是Mtb中重要的抗氧化系统,在维持生物体内的氧化还原平衡、DNA合成和氧化防御等生理过程中发挥重要作用。TrxR是可信的抗结核靶点,利用荧光探针分子快速筛选天然产物中TrxR的小分子抑制剂,发掘潜在的抗结核化合物。综上所述,开发肺结核靶标酶活性的高通量、可视化荧光检测方法,构建天然产物与靶标酶相互作用的评价体系,发掘潜在的抗结核活性成分,开发新型抗结核策略,为肺结核的治疗提供高内涵分子工具。第一部分N-乙酰转移酶2荧光可视化分析及中药抑制剂筛选在抗肺结核中的潜在应用目的:设计、开发用于检测NAT2活性的off-on型荧光探针,表征探针的荧光属性,评价探针的荧光成像功能,探究中药与NAT2的相互作用规律,考察NAT2天然抑制剂的抗菌效果,以及与抗结核药物异烟肼联合使用的抗结核效果。方法:(1)以氟硼二吡咯(4,4-difluoro-boradiazaindacene,BODIPY)为荧光团,引入苯胺作为NAT2的识别基团和荧光猝灭基团,开发检测NAT2的特异性荧光探针BDPN;(2)对探针BDPN荧光属性进行表征,建立NAT2活性评价体系;(3)利用探针BDPN对结核分枝杆菌内源性NAT2进行可视化成像检测;(4)利用探针BDPN高通量筛选对NAT2有抑制作用的中草药,以活性追踪方式对活性成分进行分离,通过扫描电镜和透射电镜观察活性成分对Mtb细胞壁的影响,考察体外抑菌活性;(5)考察活性成分与抗结核药物异烟肼联合使用时对异烟肼代谢失活过程的影响,以及联合用药对抗结核药效的影响。结果:(1)荧光探针BDPN在498 nm具有明显的吸收峰,荧光强度较弱,经NAT2催化后,在512 nm处产生明显的荧光信号,说明BDPN可以作为检测NAT2活性的off-on型荧光探针;(2)通过化学计算阐释探针及其代谢产物在激发态的电子分布,进一步说明BDPN作为检测NAT2活性的off-on型荧光探针的机理;(3)BDPN在多种生物介质中具有较好的稳定性和专一性,在多种化学抑制剂中,只有NAT2的选择性抑制剂槲皮素可以阻断乙酰化反应,分子对接结果进一步验证了BDPN对NAT2的特异性,说明BDPN可用于复杂生物样本中选择性检测NAT2的活性;(4)借助BDPN对Mtb H37Ra和M.smegmatis mc~2155的内源性NAT2进行共聚焦成像,BDPN在NAT2催化下产生明显的荧光信号;(5)借助BDPN的优越性能,从168种中草药中筛选出对NAT2抑制活性最强的中药补骨脂,并分离得到四个抑制作用较强的活性单体,其中,异补骨脂查尔酮具有较强的抗菌作用,能显著抑制BDPN在Mtb H37Ra和M.smegmatis mc~2155中的荧光信号;(6)扫描电镜和透射电镜实验表明,经异补骨脂查尔酮处理的Mtb H37Ra细菌形态明显改变,细胞壁完整度被破坏,轮廓不清;(7)异补骨脂查尔酮可以抑制Mtb H37Ra生长速度,减缓异烟肼的代谢失活速率,从而增加药物浓度,提高异烟肼在Mtb H37Ra中的抗结核效果。结论:(1)通过体外代谢评价,明确了BDPN可用作复杂生物体系中检测NAT2的高选择性off-on型荧光探针;(2)实现Mtb H37Ra和M.smegmatis mc~2155内源性NAT2的可视化检测;(3)通过高通量、可视化筛选和活性示踪方法,分离鉴定强效抑制剂异补骨脂查尔酮,可以影响Mtb H37Ra细胞壁的形成,改变细菌形态,抑制Mtb的生长;(4)异补骨脂查尔酮能够减缓异烟肼的代谢失活,增强抗结核效果。综上所述,BDPN为潜在抗结核药物的发掘、新抗结核策略的实施提供实用型分子工具。第二部分荧光高通量筛选β-内酰胺酶抑制剂改善肺结核的抗生素治疗策略目的:设计、开发用于检测β-内酰胺酶(β-lactamase,Blac)活性的近红外荧光探针,表征探针的荧光属性,评价探针的荧光成像功能,探究中草药与Blac的相互作用,与β-内酰胺类抗生素联合使用缓解Mtb的天然耐药性,达到抗结核目的。方法:(1)以半菁为荧光团,引入β-内酰胺环作为识别位点,开发Blac的特异性荧光探针LXMB;(2)通过化学计算阐释荧光机理;(3)表征探针LXMB的荧光属性,建立Blac活性评价体系;(4)通过分子对接阐释LXMB与Blac间的相互作用;(5)高通量筛选对Blac有抑制作用的中草药,在荧光示踪指示下对活性成分进行分离,通过分子对接阐释活性成分与Blac的互作规律;(6)利用探针LXMB的成像功能对Mtb H37Ra和M.smegmatis mc~2155内源性Blac进行可视化检测;(7)考察Blac抑制剂与β-内酰胺类抗生素联合使用时对Mtb H37Ra的抑菌效果。结果:(1)荧光探针LXMB在588 nm处具有明显的吸收峰,且自身荧光较弱,经Blac催化后,在700 nm处产生新的吸收峰,在724 nm处观察到明显的荧光信号,说明LXMB可以作为检测Blac活性的off-on型荧光探针;(2)化学计算阐明该探针的荧光机理,进一步说明LXMB是一种检测Blac活性的off-on型近红外荧光探针;(3)LXMB在多种内源性物质中表现出优异的稳定性,且120 min内具有良好的光稳定性;检测Blac具有较广的线性区间,化学抑制和单酶归属实验均表明其在多种生物酶中对Blac表现出优异的选择性,分子对接实验进一步阐释了LXMB对Blac高选择性和良好亲和力的原因,说明LXMB可以用于复杂生物样本中Blac的活性检测;(4)从260种中草药中筛选出对Blac具有强烈抑制作用的五倍子,在活性示踪下分离得到活性成分单宁酸;(5)单宁酸抑制Blac的IC_(50)为1.003μM,利用分子对接分析单宁酸与Blac的作用机制;(6)在共聚焦成像实验中,LXMB在内源性Blac催化下产生明显的荧光信号,抑制剂单宁酸可以减弱荧光信号的产生,能够观察到巨噬细胞吞噬LXMB标记的Mtb H37Ra,说明LXMB在成像方面具有优良性能;(7)单宁酸可以增强多种β-内酰胺类抗生素的抗结核效果。结论:(1)代谢显型、化学计算和分子对接实验表明,LXMB可用作复杂生物体系中检测Blac的特异性off-on型近红外荧光探针;(2)LXMB可以实现Mtb H37Ra和M.smegmatis mc~2155内源性Blac的可视化检测,并对巨噬细胞内被标记的Mtb H37Ra进行荧光示踪;(3)LXMB用于高通量筛选Blac抑制剂,单宁酸可以联合β-内酰胺类抗生素,显著增强抗结核效果。因此,LXMB可用于分析Mtb对β-内酰胺类抗生素的耐药机制,也为Blac抑制剂的开发提供高内涵的荧光分子工具,从而提高β-内酰胺类抗生素的抗结核效果。第三部分硫Cell wall biosynthesis氧还蛋白还原酶荧光探针的开发及天然产物中潜在抗结核药物筛选目的:设计、开发用于检测硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TrxR)活性的近红外荧光探针,表征探针的荧光属性,评价探针的荧光成像功能,探究中草药和天然产物与TrxR的相互作用,评价活性成分的抗结核效果。方法:(1)以1,3-二氯-7氨基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮(DDAN)为荧光团,引入二硫键作为识别位点,开发检测TrxR的特异性荧光探针DDAT;(2)表征探针DDAT的荧光属性,建立TrxR活性评价体系,并通过分子对接解析DDAT与TrxR的相互作用;(3)高通量筛选对TrxR有抑制作用的中草药和天然产物,在活性示踪下对活性成分进行分离鉴定,通过分子对接分析活性成分与TrxR间的相互作用;(4)利用探针DDAT的成像寻找更多功能,对Mtb H37Ra内源性TrxR进行可视化分析;(5)刃天青显色法测定巴西苏木素、胶霉毒素对Mtb H37Ra的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),并考察胶霉毒素对Mtb H37Ra生长速度的影响,通过碘化丙啶渗透实验和扫描电镜观察胶霉毒素对Mtb H37Ra的形态结构影响。结果:(1)荧光探针DDAT在TrxR的催化下生成DDAN,吸收峰发生红移,在610 nm生成新的吸收峰,并在666 nm处荧光信号显著增强,说明DDAT可以作为检测TrxR的off-on型近红外荧光探针;(2)DDAT在p H 3.0-9.0范围内具有稳定的荧光强度,在多种内源性物质中表现出优异的稳定性,在多种生物酶中对TrxR表现出高度的选择性,荧光强度的变化与TrxR浓度呈良好的线性关系,通过化学抑制实验进一步证明DDAT对TrxR的专一性,通过分子对接实验分析了DDAT与TrxR的相互作用,说明DDAT具有优异的稳定性和选择性,可以用于复杂生物样本中TrxR的活性检测;(3)从260种中草药和180种天然产物中筛选出对TrxR具有强烈抑制作用的苏木和胶霉毒素,在活性示踪下分离得到活性成分巴西苏木素,通过分子对接实验分析了巴西苏木素和胶霉毒素与TrxR的相互作用;(4)借助DDAT对Mtb H37Ra的内源性TrxR进行共聚焦成像,DDAT在TrxR催化下产生明显的荧光信号,抑制剂Ebselen和胶霉毒素可以减弱荧光信号;(5)巴西苏木素和胶霉毒素对Mtb H37Ra具有显著抑制作用,破坏Mtb H37Ra细胞壁的完整性,改变菌体形态。结论:(1)代谢显型和分子对接实验确证DDAT可用作复杂生物体系中检测TrxR的高选择性近红外荧光探针;(2)DDAT可以实现Mtb H37Ra内源性TrxR的可视化检测;(3)DDAT用于高通量筛选TrxR抑制剂,发挥抗结核作用。DDAT可用于分析Mtb中TrxR活性,为筛选TrxR特异性抑制剂、新型抗结核药物的开发提供实用的荧光分子工具。