第一部分 抗MDA5抗体IgG亚型对皮肌炎合并间质性肺病患者预后提示价值的评估及验证目的:探讨抗黑色素瘤分化相关基因5(melanoma differentiation associated gene 5,MDA5)抗体IgG亚型与皮肌炎(dermatomyositis,DM)合并间质性肺病(interstitial lung disease,ILD)患者预后的关系。方法:本回顾性研究包括2017年10月至2020年10月收治于中日友好医院风湿免疫科的122名抗MDA5抗体阳性(anti-MDA5+)的DM-ILD患者作为训练队列,以及2014年8月至2017年9月收治的68名anti-MDA5+DM-ILD患者作为验证队列。使用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbeGSK1120212说明书nt assay,ELISA)测定抗MDA5总IgG和IgG亚型的水平,并与患者的预后进行相关分析。结果:在训练队列中,死亡组的抗MDA5抗体IgG1和IBLZ945溶解度gG3浓度显著高于生存组(P<0.05),而IgG2和IgG4水平没有显著差异。Kaplan-Meier生存分析显示,抗MDA5抗体总IgG、IgG1和IgG3的水平与DM-ILD患者死亡相关(P<0.05)。多因素分析显示抗MDA5抗体IgG1>13U/mL和抗MDA5抗体IgG3>1 1U/mL是DM-ILD患者死亡的独立危险因素(P<0.05)。而在验证队列中,抗MDA5抗体IgG1被验证为DM-ILD患者死亡的独立危险因素,抗MDA5抗体IgG3不是DM-ILD患者死亡的独立危险因素。与抗MDA5抗体总IgG、IgG3,或IgG1联合IgG3(约登指数分别为0.356、0.32和0.447)相比,抗MDA5抗体IgG1(约登指数0.494)对患者预后的鉴别能力更大。结论:抗MDA5抗体IgG1和IgG3与DM-ILD患者的预后不良显著相关,抗MDA5抗体IgG1作为DM-ILD的预后生物标志物更有效。第二部分外周血CD8+T细胞耗竭与抗MDA5抗体阳性皮肌炎患者肺部真菌感染风险增加相关目的:探讨特发性炎性肌病(idiopathic inflammatory myopathies,IIM)患者外周血CD8+T细胞耗竭标志物的表达及其临床意义。方法:选取IIM患者88例和29例健康对照(HC)纳入研究,其中anti-MDA5+DM患者42例,抗MDA5抗体阴性DM(anti-MDA5-DM)患者18例,免疫介导的坏死性肌病(immune-mediated necrotizing myopathy,IMNM)患者 17 例,抗合成酶综合征(anti-synthetase syndrome,ASS)患者11例。流式细胞术检测外周血CD8+T细胞表面程序性死亡受体1(programmed death 1,PD-1),淋巴细胞活化基因3(lymphocyte-activation gene 3,LAG3),T 细胞免疫球蛋白黏蛋白分子 3(mucin domain-containing protein 3,TIM-3)的表达。分析 anti-MDA5+DM 患者外周血CD8+T细胞耗竭表型的临床相关性。结果:Anti-MDA5+DM患者外周血CD8+T细胞的LAG-3和TIM-3表达水平显著高于 anti-MDA5-DM、IMNM、ASS和 HC(校正后 P均<0.05)neonatal pulmonary medicine。与 anti-MDA5-DM组和HC组相比,anti-MDA5+DM组CD8+T细胞表面PD-1表达水平升高(校正后P均<0.05)。与HC组相比,anti-MDA5+DM患者轻度耗竭表型(PD-1或TIM-3或LAG-3任一指标阳性)、中度耗竭表型(PD-1、TIM-3及LAG-3中两个指标阳性)和重度耗竭表型(PD-1、TIM-3及LAG-3三个指标均阳性)的外周血CD8+T细胞均显著增多(P均<0.05)。外周血存在高比例PD-1+TIM-3+LAG-3+CD8+T细胞的anti-MDA5+DM患者肺部真菌感染的发生率更高,乳酸脱氢酶(LDH)、血清铁蛋白水平更高,CD4+T细胞和CD8+T细胞计数更低。ROC曲线分析显示,外周血PD-1+TIM-3+LAG-3+CD8+T细胞比例水平对anti-MDA5+DM患者发生肺部真菌感染具有显著预测价值(AUC=0.828,P<0.05)。结论:Anti-MDA5+DM患者外周血存在明显的CD8+T细胞耗竭表型,具有重度耗竭表型的CD8+T细胞比例增加与anti-MDA5+DM患者发生肺部真菌感染的高风险相关。第三部分ACSL1介导的铁死亡在抗MDA5抗体阳性皮肌炎患者外周血T细胞减少中的作用目的:明确anti-MDA5+DM患者外周血T细胞的铁死亡活化并探讨其发生机制。方法:通过蛋白质印迹法及流式细胞术检测95例IIM患者(含anti-MDA5+DM患者65例)及46名与患者年龄性别相匹配的HC的外周血T细胞GPX4蛋白表达水平;透射电镜分析T细胞线粒体形态变化;活细胞荧光染色分析T细胞铁代谢及脂质代谢情况;通过ELISA测定血浆中丙二醛(MDA)水平。体外实验通过质粒转染使T细胞GPX4过表达,来探究GPX4对T细胞铁死亡的影响。通过蛋白质印迹法分析anti-MDA5+DM患者T细胞ACSL家族(ACSL1,3,4)蛋白表达水平。体外实验探究α-ESA刺激下对anti-MDA5+DM患者外周血T细胞铁死亡的影响。结果:蛋白质印迹法及流式细胞术检测发现GPX4在T淋巴细胞减少的anti-MDA5+DM组较T淋巴细胞正常的anti-MDA5+DM组,其他IIM组以及HC组表达显著降低(P<0.05)。电镜分析发现T淋巴细胞减少的anti-MDA5+DM患者外周血T淋巴细胞表现出典型的铁死亡形态学特征。活细胞荧光染色分析发现T淋巴细胞减少的anti-MDA5+DM患者外周血T细胞胞内Fe2+水平及细胞脂质过氧化物水平较健康人明显升高(P<0.05)。ELISA测定anti-MDA5+DM患者血浆中MDA水平较其他IIM组及HC组明显升高(P<0.05)。体外实验证实T细胞GPX4过表达可增强T淋巴细胞减少的anti-MDA5+DM患者外周血T细胞对铁死亡的抗性。蛋白质印迹法分析T淋巴细胞减少的anti-MDA5+DM患者T细胞ACSL1表达水平明显上调,体外实验证实α-ESA通过ACSL1介导T淋巴细胞减少的anti-MDA5+DM患者T细胞铁死亡。结论:T淋巴细胞减少的anti-MDA5+DM患者的T细胞存在铁死亡。GPX4表达下调及ACSL1介导的脂质代谢异常可能是T细胞发生铁死亡的原因。