鸡白痢是危害养鸡业最严重的疫病之一,在全国范围内均有流行,可在鸡群中水平和垂直传播,对鸡群健康造成严重危害,给家禽养殖业带来巨大的经济损失。目前防控鸡白痢以净化为主,但抗生素治疗仍然是防控鸡白痢的重要方法。抗生素的使用导致细菌耐药率上升,多重耐药菌株增加,同时带来药物残留问题,对公共卫生安全造成严重威胁。在养殖业减抗限抗的大趋势下,中草药及中药单体具有来源广泛、毒性小和不易产生耐药、能增强动物免疫力等优点,成为新型抗细菌感染药物研发的天然资源库。杨树花在治疗动物细菌性痢疾方面应用已久且疗效显著,杨梅素及二氢杨梅素是杨树花中潜在的抑菌活性成分,研究表明,这两种成分具有抗炎、抗氧化,抗菌等作用,但杨梅素及二氢杨梅素在杨树花中的含量,对鸡白痢沙门菌的作用及其机制尚不清楚。因此,本文,评估了杨梅素及二氢杨梅素对鸡白痢沙门菌的抑菌及抗感染作用,并从转录水平分别研究了二者的作用机制,同时建立基于液相色谱技术的方法,测定了杨树花中杨梅素及二氢杨梅素的含量。研究结果可为两种中药单体及杨树花的开发利用提供理论依据。1.杨梅素及二氢杨梅素对鸡白痢沙门菌生长和毒力的影响经微量肉汤稀释法测定,杨梅素及二氢杨梅素对鸡白痢沙门菌标准株的最小抑菌浓度(MIC)分别为312.5μg/m L和625μg/m L;MBC分别为625μg/m L和1250μg/m L。通过活菌计数法测定药物作用下细菌的生长曲线,结果显示两种药物在1/8MIC及以上浓度均能显著抑制细菌生长;在1/16MIC浓度下,杨梅素能够使生长中期的细菌数量有轻微下降,二氢杨梅素则能延滞细菌生长时间,两种药物在更低浓度则对细菌生长无显著抑制作用。采用结晶紫染色法测定两种药物对试验菌生物被膜形成的影响,结果显示,1/4MIC杨梅素对生物被膜形成的抑制率达到64.6%(P<0.05)。而二氢杨梅素在1/4MIC浓度下无显著抑制作用。利用庆大霉素保护试验,测定两种药物预处理后,鸡白痢沙门菌黏附侵袭鸡胚成纤维细胞DF-1的能力,结果表明,杨梅素在不影响细菌生长的浓度(19.531μg/m L即1/16MIC)下,能显著抑制鸡白痢沙门菌对鸡胚成纤维细胞DF-1的黏附侵袭能力,其中,对黏附力的抑制率为69.14%(P<0.05),对侵袭力的抑制率为59.31%(P<0.05)。而二氢杨梅素组在不影响细菌生长的浓度下,对鸡白痢沙门菌的黏附与侵袭能力无显著影响。2.杨梅素及二氢杨梅素的作用机制研究为研究杨梅素抗鸡白痢沙门菌感染的作用机制,使用不影响细菌生长的杨梅素浓度(19.531μg/m L)对鸡白痢沙门菌进行预处理,收集菌体进行转录组学分析。主要结果如下:杨梅素可下调表达与鸡白痢沙门菌生物被膜形成相关的基因,包括鞭毛基因调节子flh D、flh C、tab A;生物膜过氧化抗性基因bsm A,菌毛基因bcf F等。同时,杨梅素可显著下调与鸡白痢沙门菌黏附侵袭能力相关的基因,包括T3SS-1的效应因子sip ABCD和sop BDE,T3SS装置基因inv AEG等;通过KEGG功能富集分析发现,杨梅素作用下,鸡白痢沙门菌的差异表达基因主要分布于细菌侵袭上皮细胞、细菌性痢疾病、铁载体基团非核糖体肽的生物合成通路。在细菌侵袭上皮细胞通路中差异表达最显著基因为T3SS-1效应蛋白编码基因sop E、sip D、sip B。在细菌性痢疾病通路中差异表达最显著基因为T3SS-1效应蛋白编码基因sip D、sop B和装置基因prg J,这些基因均显著下调表达且与T3SS相关。通过q RT-PCR测定了细菌Ⅲ型分泌系统(T3SS-1)相关基因的转录水平,结果显示,在不影响细菌生长的浓度下,杨梅素能显著抑制T3SS-1、效应因子(sip A、sip B、inv A等)、装置基因(prg H、prKPT-330抑制剂g K、inv G等)及调控基因(hil A、hil D、hil C等)的转录水平。进一步分析铁载体基团非核糖体肽的生物合成通路发现,其中差异最显著的基因是2,3-二羟基苯甲酸酯-AMP连接酶基因ent E、异分支酸合酶基因ent C、肠杆菌素合酶装置基因ent F等,这些基因均显著上调表达,且均为铁离子转运载体肠杆菌素(Enterobactin)合成相关基因,说明杨梅素作用对细菌铁离子吸收产生显著影响作用。为研究二氢杨梅Acute respiratory infection素抑制鸡白痢沙门菌生长的作用机制,使用抑菌浓度(625μg/m L即1MIC)二氢杨梅素对临近生长对数期的细菌进行预处理,收集菌体进行转录组学分析。结果如下:二氢杨梅素对鸡白痢沙门菌的影响主要与核糖体、硫代谢、丙酮酸代谢,三羧酸循环,抗坏血酸和醛酸代谢这5条通路相关,其中表达量差异最显著基因是硫代硫酸盐还原酶基因(phs A),二甲基亚砜还原酶基因(dms A),甲酸乙酰转移酶基因(pfl B),延胡索酸酶基因(fum A),丙酮酸激酶基因(pck A),延胡索酸还原酶亚基基因(frd D),PTS系统EIIB基因(ula B)和EIIC基因(ula C)。结果表明,二氢杨梅素对鸡白痢沙门菌基因的表达具有广泛的影响,主要通过5条通路及通路中的显著差异表达基因发挥抑菌作用。3.杨树花中杨梅素和二氢杨梅素含量的测定建立了基于高效液相色谱(HPLC)技术的检测方法,测定杨树花中杨梅素和二氢杨梅素的含量。方法采用C18 HPLC Column(25 cm×4.6 mm,5μm)色谱柱,以甲醇为流动相A,以0.03%磷酸水溶液为流动相B,进行梯度洗脱,流速为0.8 m L/min,柱温为35℃,检测波长:二氢杨梅素290 nm、杨梅素373nm。结果显示,在1.937 5～62 mg/L范围内杨梅素的标准曲线方程为y=24.6470x+3.772 9,相关系数R~2=0.999 8,在2.35～75.2 mg/L范围内二氢杨梅素的标准曲线方程为y=16.854 0x+8.250 2,相关系数R~2=0.999 8。线性回归方程相关系数均接近1,且均在95%可置信区间内,同时精密度、重复性良好。用此法检测杨树花样品3次,计算得样品中杨梅素的含量平均为185.26 mg/kg;二获悉更多氢杨梅素的含量平均为为485.94 mg/kg。