中国是世界上最大的马铃薯生产国之一,2018年马铃薯生产面积超过481万公顷,生产马铃薯达18064万吨,分别占世界马铃薯种植面积和马铃薯产量的27.36%和24.53%。随着马铃薯产业的蓬勃发展,困扰马铃薯产业intensity bioassay的问题也越来越多,其中球炭疽菌做为危害马铃薯的病原之一,不仅使得马铃薯减产,而且严重影响马铃薯的商品性。为研究球炭疽菌引起的马铃薯炭疽病的生物防治,筛选优良拮抗菌株,并研究其抑菌机制非常必要。本试验研究对象为分离自东祁连山高寒草地牧草珠芽蓼中的枯草芽孢杆菌ZA1S,前期研究结果表明其对球炭疽菌(Colletotrichum coccodes)的拮抗能力突出,其乙酸乙酯萃取液表现出较强抗菌活性。本试验通过柱层析法和多种光谱信息确定代谢物的结构,结合转录组学和代谢组学挖掘菌株ZA1S在抗病过程中的功能基因,取得以下成果:1.枯草芽孢杆菌ZA1S抑菌活性研究内生菌株ZA1S对11株病原真菌均具有拮抗作用,其中对球炭疽菌和辣椒炭疽菌(C.tabaci)的抑制率分别达81.93%和78.82%;乙酸乙酯提取液对球炭疽菌的抑制率为31.48%,使球炭疽菌的产孢量从1.1×10~6个/m L下降至5.8×10~5个/m L,对辣椒炭疽菌的孢子萌发抑制率高达83.67%。该结果表明ZA1S可从菌丝生长、产孢和孢子萌发3个方面起到抗菌作用,具有开发为优良生物控制剂的潜力。根据菌株ZA1S的形态特征和分子聚类分析将其鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。2.枯草芽孢杆菌ZA1S代谢物的分离及鉴定从内生菌株ZA1S代谢物中共分离得到6个化合物,经多重光谱方法分析,分别鉴定selleck NMR为环(亮氨酸-酪氨酸)二肽(Bs1)、环(酪氨酸-苯丙氨酸)二肽(Bs2)、胸腺嘧啶(Bs3)、染料木苷(Bs4)、黄豆苷源(Bs5)和金雀异黄酮(Bs6),其中,Bs1至Bs6对球炭疽菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为0.8 mg·m L~(-1)、0.8 mg·m L~(-1)、2 mg·m L~(-1)、1 mg·m L~(-1)、1 mg·m L~(-1)和0.5 mg·m L~(-1),抗菌活性差异显著,与福美双的MIC值为1.25 mg·m L~(-1)相比,除胸腺嘧啶外,其余化合物抑菌能力均较强,进一步证实菌株ZA1S开发为生防制剂的可靠性。3.枯草芽孢杆菌ZA1S代谢物体外抗氧化活性研究6种代谢物均具有清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基的能力,其中染料木苷清除效果最明显,清除率为67.19%;除胸腺嘧啶外,其他代谢物清除2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基的能力更强,清除率均达到99%以上,且与代谢物浓度呈正相关;6个化合物对·OH的清除能力比较一致,清除率介于63%-72%之间,呈现出计量依赖的特征。染料木苷浓度为1 mg·m L~(-1)时,对O_2~-·的清除率最高,为67.84%,其他5个代谢物对O_2~-·的清除效果不明显。该结果表明菌株ZA1S代谢物在体外具有较好的抗氧化活性,为菌株ZA1S附加产品的开发和应用提供理论依据。4.枯草芽孢杆菌ZA1S代谢物抑制球炭疽菌的作用方式6种代谢物处理球炭疽菌后,菌丝分别表现出扭曲、内含物增加、停止生长、菌丝膨胀和分枝增加的症状;当染料木苷、黄豆苷源和金雀异黄酮使用剂量分别为0.5 mg·m L~(-1)、0.25 mg·m L~(-1)和0.5 mg·m L~(-1)时对菌丝细胞膜造成的破坏最大,检测到丙二醛(MDA)浓度分别为0.98 mmol·L~(-1)、0.73 mmol·L~(-1)和0.86 mmol·L~(-1),另外3种代谢物处理后MDA值最大为0.33 mg·m L~(-1),表明病原菌菌丝细胞膜受损程度较小;当胸腺嘧啶、染料木苷、黄豆苷源和金雀异黄酮的浓度分别为0.25mg·m L~(-1)、0.125 mg·m L~(-1)、0.125 mg·m L~(-1)和0.0625 mg·m L~(-1)时麦角甾醇合成受阻,随着浓度的升高麦角甾醇无法参与细胞膜的合成;环(亮氨酸-酪氨酸)二肽、环(酪氨酸-苯丙氨酸)二肽、染料木苷、黄豆苷源和金雀异黄酮浓度分别为0.1mg·m L~(-1)、0.1 mg·m L~(-1)、0.125 mg·m L~(-1)、0.125 mg·m L~(-1)和0.0625 selleck产品mg·m L~(-1)时,蛋白含量最低,分别为298μg·m L~(-1)、301μg·m L~(-1)、334μg·m L~(-1)、328μg·m L~(-1)和337μg·m L~(-1);当染料木苷、黄豆苷源和金雀异黄酮的浓度分别为1 mg·m L~(-1)、1 mg·m L~(-1)和0.5 mg·m L~(-1)时,菌丝体的胞外纤维素酶(Cx)活性分别下降3倍、1.2倍和1.4倍。该结果表明,菌株ZA1S产生的代谢物抗真菌作用可能是通过破坏菌丝结构,导致菌丝体细胞渗漏等造成。5.联合转录组学和代谢组学揭示枯草芽孢杆菌ZA1S抑制球炭疽菌的关键基因为明确枯草芽孢杆菌ZA1S防治球炭疽菌过程中发挥调控作用的基因,所以对菌株ZA1S进行转录组和代谢组分析。利用转录组测序筛选到4168个差异表达基因,其中1026个基因上调表达,2130个基因下调表达;1911个差异基因富集到生物反应、细胞组分和分子功能中,富集基因数分别为768(上调141,下调111)、235(上调119,下调116)和874(上调210,下调202),主要在氧化-还原过程、发育过程、膜的作用和氧化还原酶活性等生物过程中发挥作用;差异基因显著富集在7个KEGG信号通路中,最主要的是辅助因子的生物合成和嘌呤代谢,具有调控作用的差异基因188个,其中上调95,下调93。通过代谢组学筛选到529个差异代谢物,35个代谢物上调,28个代谢物下调;上调代谢物包括D-甘露醇、半乳糖醇、9,12,13-三羟基-10,15-十八碳二烯酸、顺式乌头酸和腺苷-5′-单磷酸等,下调代谢物有3-吲哚丙烯酸、L-焦谷氨酸、L-哌啶酸、N6-(2-羟乙基)腺苷等;富集在88个KEGG通路中,代表性通路包括赖氨酸降解、核苷酸代谢、柠檬酸循环(TCA循环)、乙醛酸和二羧酸的代谢和磷酸转氨酶系统(PTS)等相关通路。分析表明,差异基因和差异代谢物共同富集的前25个KEGG通路中,其中5个代谢物和18个基因注释在乙氧基化物和二羧酸盐通路中,8个代谢物和86个基因注释在辅助因子的生物合成通路中,6个代谢物和11个基因注释在赖氨酸的降解通路中。筛选出3个典型的差异代谢物顺式乌头酸、腺苷-5′-单磷酸和L-哌啶酸,分别被亚氯酸盐歧化酶家族、硫醇酶,N端结构域|硫醇酶,C端结构域、醛脱氢酶家族、吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶|吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶,二聚结构域和吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶,二聚结构域|吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族中的基因调控。抑制球炭疽菌生长过程中高含量的顺式乌头酸和腺苷-5′-单磷酸以及低含量的L-哌啶酸有助于拮抗作用的产生。调控3个差异代谢物的基因hem Q、ald Y、ald X、lpd A1、lpd A2、aco L和yhf S的表达量均高于对照,说明这些基因在抑制球炭疽菌的过程中发挥重要作用。