黄酮类化合物是广泛分布于植物中的一类次生代谢产物,具有调控植物生长素运输、雄性育性、对UV-B照射的保护、参与花和果实的着色、共生体吸引和授粉昆虫的招募等功能,同时黄酮类化合物参与植物对特定激素的反应。黄酮类化合物对人体健康具有广泛的益处,其中黄酮醇及其糖苷衍生物已被证实具有抗氧化、抗肿瘤、心血管保护等药理作用。黄酮糖苷在植物中广泛存在,其中数量最多的是黄酮醇氧苷,糖基化通常是天然产物修饰的最后一步,糖基化可以提高黄酮类化合物的水溶性,从而提高其生物利用度,并且利用植物糖基转移酶酶催化和工程菌转化等方法生产黄酮类化合物葡萄糖苷相对经济和方便,具有较大的应用前景。桑科植物柘树(Cudrania tricuspidata)中含有大量黄酮类化selleck PEG300合物,但柘树中黄酮类化合物生物合成途径尚未被解析,本研究主要关注于黄酮醇糖苷的生物合成,黄烷酮经F3H(Flavanone 3-hydroxylase)催化生成二氢黄酮醇,接着被FLS(Flavonol synthase)催化生成黄酮醇,黄酮醇被 UGT(UDP-Glycosyltransferase)糖基化生成对应的糖苷。本研究旨在鉴定柘树黄酮醇糖苷合成关键酶F3H、FLS以及UGT并对它们的催化特性进行研究,为黄酮醇糖苷的生物合成提供候选基因,开展了以下研究:1.柘树F3H和FLS的基因克隆与功能研究在柘树转录组数据库功能注释表中搜索关键词“flavone 3-hydroxylase”,结合生物信息学分析筛选得到F3H和FLS候选基因,异源表达的重组蛋白进行体外酶活功能验证,CtrF3H1、CtrF3H2具有黄烷酮3-羟化酶(F3H)的活性,能够催化柚皮素生成二氢山奈酚,CtrFLS具有黄酮醇合酶(FLS)的活性,催化二氢山奈酚生成山奈酚。底物选择性实验结果表明,CtrF3H1、CtrF3H2具有底物选择性差异,CtrF3H2具有更强的底物杂泛性,对柚皮素、圣草酚、橙皮素、甘草素四种黄烷酮有较强的催化活性,而CtrF3H1仅对柚皮素、圣草酚有较强的催化活性。通过氨基酸定点突变实现了 CtrF3H1底物杂泛性的增强,确定了影响CtrF3H1、CtrF3H2底物杂泛性的关键氨基酸位点。以CtrF3H1为代表研究了其在生物体内的功能,CtrF3H1在大肠杆菌内同样具有F3H的功能;进一步研究了CtrF3H1在植物体内的功能,结果表明,CtrF3H1转基因拟南芥较tt6植株黄酮醇山奈酚和槲皮素及黄酮金圣草素和芹菜素含量增加,表明CtrF3H1在植物体内发挥着 FNS Ⅰ(Flavone synthase Ⅰ)和 F3H 双功能。2.柘树UGT的基因克隆与功能研究在柘树转录组数据库功能注释表中搜索关键词“flavonoid 3-O-glucosyltransferase”,结合生物信息学分析筛选得到UGT候选基因,异源表达UGT重组蛋白,纯化蛋白以UICI 46474DP-葡萄糖为糖供体,以各类黄酮类化合物为底物进行体外酶活功能的探究,结果显示,CtrUGT1和CtrUGT2对多种黄酮类化合物具有糖基化的活性。CtrUGT1能够催化更多的黄酮类化合物并且具有更强的活性,且CtrUGT1具有分别催化3位、7位、3’位3个位置生成对应的单葡萄糖苷的活性,而CtrUGT2只能催化3位、7位2个位置糖基化。CtrUGT1在大肠杆菌体内同样具有更强的催化活性和效率,CtrUGT1可作为黄酮糖renal biomarkers苷生物合成候选基因。