植物激素(Phytohormones)是指植物内源产生的一类信号分子,参与了包括调控植物生长发育、介导植物的免疫应答等多种生理过程,在植物适应各种环境胁迫的过程发挥着关键作用。植物激素对于药用植物在逆境中生存及调控次生代谢产物含量的过程中具有重要意义,其作用机理研究一直是植物生理和抗逆境研究的热点问题。植物激素发挥作用首先需与植物体内受体蛋白结合,但是系统性的鉴定植物激素结合蛋白并研究其功能仍是相关研究领域的难点。研究目的由于植物激素在不同的高等植物中作用高度相似,本课题以拟南芥作为模式系统,建立起系统性研究植物激素结合蛋白的方法和技术平台,并探究其功能。本课题以水杨酸和脱落酸两种植物激素为例,建立起了化学蛋白质组学研究平台,系统研究了这两种激素分子的作用蛋白和调控的分子机制,以期为重要中药材的种植和抗逆境提供科学参考。研究方法(1)基于化学蛋白质组学解析水杨酸的作用机理。水杨酸(Salicylic acid,SA)是一种防御激素,可以使植物在生物和非生物胁迫条件下更好地适应环境。在这Galunisertib化学结构里,selleck Z-VAD-FMK我们使用化学蛋白质组学的方法来揭示拟南芥中SA介导的蛋白质组重塑机制,追踪SA影响的新合成蛋白质的机理以及使用该技术寻找新的SA结合蛋白(SA binding proteins,SABPs)。首先,采用生物正交非天然氨基酸标记方法(Bioorthogonal noncanonical amino acid tagging,BONCAT)结合点击化学来标记拟南芥中新合成的蛋白质,在本研究中,使用的探针是甲硫氨酸的类似物L-Azidohomoalanine(AHA),在其氨基酸侧链中带有的叠氮基团,可以通过click反应选择性地修饰和富集标记的新合成的蛋白质。此外,我们基于SA的结构设计合成了水杨酸探针(Salicylic acid probe,SA-P),结合点击化学反应,筛选出SA-P在拟南芥裂解液中合适的标记浓度。采用基于活性的蛋白质分析技术(Activity-based protein profiling,ABPP)和液相色谱仪-串联质谱法(Liquid chromatograph-tandem mass spectrometer,LC-MS/MS)技术,鉴定了水杨酸在拟南芥裂解液中的结合蛋白。通过生信分析手段对结合蛋白进行信号通路富集分析以及功能聚类分析,筛选出目标蛋白以及其涉及的信号通路。通过构建基因表达载体以及外源表达纯化相应的目标蛋白。并通过纯蛋白的标记和竞争实验,表面等离子共振技术(Surface plasmon resonance,SPR)以及差示扫描荧光法(Differential scanning fluorimetry,DSF)验证SA可否结合这些蛋白。通过蛋白质谱检测探寻SA与目标蛋白的结合位点。通过蛋白质免疫印迹试验(Western blotting,WB)分析SA处理对目标蛋白表达及活性的影响。(2)基于化学蛋白质组学解析脱落酸的作用机理。根据脱落酸(Abscisicacid,ABA)的化学结构式,设计并合成脱落酸探针(Abscisicacidprobe,ABA-P)。利用模式植物拟南芥,通过点击化学反应,筛选出ABA-P在拟南芥裂解液中合适的标记浓度。同时利用蛋白质谱定性、定量分析了脱落酸的结合蛋白。通过生信分析手段筛选出高可信度并具有一定研究意义的目标蛋白。通过构建基因表达载体以及外源表达纯化相应的蛋白。并通过纯蛋白的标记和竞争实验以及表面等离子共振技术(Surface plasmon resonance,SPR)验证目标蛋白是否与ABA结合。同时利用酶活性检测试剂盒,考察ABA对目标蛋白酶活性的影响。通过蛋白质谱寻找ABA与目标蛋白的具体结合位点并进行验证。此外,我们通过RT-qPCR实验比较了野生型(Wild type,WT)和突变体中ABA相关marker基因的表达量。研究结果(1)通过生物正交BONCAT实验结果显示,AHA探针能够有效标记拟南芥中新合成蛋白质,且SA能够以剂量依赖型的方式抑制拟南芥中新生成蛋白的合成。结合质谱分析结果我们发现,水杨酸主要通过抑制蛋白质合成所需的核糖体蛋白来重塑拟南芥蛋白质组以适应环境压力。我们设计并合成了水杨酸探针(SA-P),用于寻找相应的SABPs。SA-P具有类似SA的功能,可诱导病原相关基因(PR1及WRKY51)的表达,并且能够结合已知的SABPs,甘油醛-3-磷酸脱氢酶C2(GAPC2)。基于ABPP技术,SA-P可呈剂量依赖性的标记拟南芥裂解液中的相互作用蛋白,且随着SA竞争浓度的增加,SA-P结合的蛋白减少。随后通过ABPP联合LC-MS/MS分析,鉴定得到了 126个SA结合蛋白。我们对目标蛋白进行功能聚类分析,结果表明,氨基酸生物合成过程是最显著的通路之一。此外,值得注意的是,涉及翻译的相互作用蛋白被SA-P靶向,在蛋白-蛋白相互作用(Protein-proteininteractions,PPI)分Clinical immunoassays析中占据了重要位置。我们筛选了翻译相关的蛋白,在体外测试了 SA与其相互作用蛋白的结合。通过纯蛋白的竞争实验、DSF和SPR等实验,证实了 SA可以直接结合真核细胞起始因子2(Eukaryotic translation initiator factor 2α,eIF2α)和核糖体家族蛋白RPS8A。通过蛋白质谱发现SA-P可与eIF2α蛋白的赖氨酸结合,作为SA的潜在结合位点。SPR分析得出SA与eIF2α蛋白的结合常数KD为3.53 μM,表明SA可能通过相对高亲和力的结合直接调节eIF2α的活性。此外,WB实验表明,SA处理能够促进eIF2α蛋白磷酸化而不影响总蛋白水平。(2)根据脱落酸的化学结构,成功合成了脱落酸探针(ABA-P)。ABA-P具有类似脱落酸的活性,可上调ABA应答基因RD29A表达量,表达量与ABA处理相近。基于ABPP技术,ABA-P在拟南芥裂解液中的标记效率呈浓度依赖性增强,且随着ABA竞争浓度的增加,ABA-P结合的蛋白减少。确定探针标记浓度之后进行后续的ABPP联合LC-MS/MS分析。生信分析表明,GSTF9和GSTF10是可信度较高并与谷胱甘肽代谢通路相关的目标蛋白,属于植物中一类重要的抗逆蛋白。然后,通过纯蛋白的竞争实验和SPR等实验,证实了 ABA可以直接结合GSTF9和GSTF10蛋白并且抑制其谷胱甘肽转移酶的活性。进一步通过蛋白质谱等方法,证明了 ABA可结合GSTF9和GSTF10蛋白的Lys152位。此外,GSTF10能够影响ABA信号通路相关marker基因的表达,这些结果表明GSTF10可以直接结合ABA并且可能参与了脱落酸代谢通路。研究结论综上,我们的研究发现,SA通过抑制蛋白质合成来调控拟南芥蛋白质组重塑以适应逆境。SA可以直接结合真核翻译起始因子eIF2α并促进其磷酸化,同时可能影响氨基酸的生物合成通路从而导致蛋白翻译抑制,发挥免疫功能。此外,ABA能够直接结合GSTF家族蛋白,为解释ABA参与植物抗逆的机制原因提供了可能的参考依据。本研究的发现可以为深入探索植物激素在调控植物稳态过程中发挥的作用以及解析植物在逆境中生存的机制提供重要的理论依据。