近年来,声称自己皮肤敏感的人群比例越来越高,主要表现为皮肤刺痛感、灼热感、痒感,这些症状的生理机制与皮肤屏障受损、皮肤神经感受异常、皮肤炎症有关。诱发敏感肌的因素很多,例如年龄、内分泌、气候、化妆品成分等等。其中,最常与皮肤接触的化学物质——表面活性剂对皮肤的刺激作用受到广泛关注和证实。因此,开发温和不刺激的表面活性剂原料是一种缓解敏感肌问题的解决方案。非致病酵母菌代谢得到的槐糖脂(SL)具有绿色温和、表面活性良好、独特生物活性等特质,可作为缓解敏感肌的一种天然原料,在个人护理及清洁领域具有很大潜力。然而,槐糖脂在国内大规模工业生产应用的实例很少,已被报道的提纯工艺较为复杂繁琐;关于槐糖脂生物活性的研究支撑数据相当少,需要进一步的机理探究。因此,本文研究了槐糖脂的提纯工艺优化及其针对敏感肌的抗炎舒缓功效,具体研究内容与结论如下:1.采用水洗法提纯发酵得到的SL,经过单因素筛选、正交优化后的水洗法提纯工艺为45℃下,p H为4,洗涤水添加量为1倍产物体积,水洗次数为3次。在此最优组合条件下,发酵液的蛋白脱除率为55.37%,糖脂损失率为9.90%。通过液质联用分析产物的组成结构,结果显示自制SL中酸型和内酯型的构型比例约为24:76,其中分子量为688的双乙酰化内酯型SL为产物的最主要成分。体外玉米醇溶蛋白实验及血红细胞溶血测试显示自制SL的超温和性,几selleck IDN-6556乎不与蛋白及细胞膜发生反应;透明质酸酶抑制实验的结果表明SL具备抗炎舒敏的潜力。2.建立LPS诱导的小鼠巨噬细胞体外炎症模型,在MTT细胞活力测试基础上,探究了SL抗炎的生物活性。结果显示SL能够显著减selleck PS-341少LPS诱导的炎症因子NO、IL-6、TNF-α的过度分泌,下调细胞内ROS、钙离子水平,降低i NOS、COX-2 m RNA的过度表达。同时,不同浓度的SL单独刺激细胞不会诱导细胞分泌额外的促炎因子,说明SL具有良好的抗炎活性。3.为了解释SL抗炎活性的具体机制,考察了SL对炎症反应中的关键转录因子之一NF-κB的调控作用。细胞免疫荧光染色实验的结果显示SL预处理可明显抑制LPS诱导的NF-κB核转录。此外,采用Western blotting法检测了SL对转录过程中p65和IκBα蛋白表达及磷酸化比例,结果显示不同浓度的SL预处理均能够抑制炎症引起的p65和IκBα的磷酸化过表达,降低磷酸化比例,说明在LPS诱导的体外炎症模型中,SL可以抑制炎症相关NF-κB通路的激活。分子对接辅助预测的结果表明,SL的作用靶点可能是Toll样受体复合物以及膜内激酶,从而阻止炎症信号的进一步传递。4.建立组胺诱导的体内小鼠瘙痒模型及体外角质细胞钙内流模型,在MTT细胞活力测试基础上,探究了SL舒缓皮肤瘙痒的生物活性。皮肤瘙痒刺激物组胺能够诱发小鼠的抓挠行为,行为学结果显示,SL对组胺引起的小鼠抓挠行为有抑制作用。小鼠抓挠部位皮肤的H&E染色图显示SL可以缓解皮肤瘙痒加剧后的屏障受损及炎症。利用荧光酶标仪、荧光显微镜,考察了SL对组胺诱导的Ha Ca T细胞钙内流的影响,结果表明不同浓度的SL预处理后,组胺诱导的钙内流被显著抑制。5.为了研究SL舒缓瘙痒的分子机制,首先利用钙的荧光标记,考察了在组胺刺激时SL与组胺H1或H4受体之间是否存在相互作用,结果表明SL可以通过与组胺H1、H4受体发生作用,抑制下游信号传导。此外,RT-PCR的结果显示,不同浓度的SL能够分别显著抑制组胺受体激活导致的PLCγ1、IP3R、PKCα信号分子基因的过度表达。为了进一步探讨SL抑制钙内Genetic compensation流的机制,研究了SL是否可以调控下游阳离子通道TRPV1的激活,结果显示SL能够下调TRPV1激活剂辣椒素诱导的钙内流。免疫荧光标记结果表明SL能够抑制辣椒素或组胺导致的TRPV1过度荧光表达,具有调节TRPV1通道活性的能力,分子对接预测结果表明SL可能通过相互作用的方式抑制刺激物激活TRPV1。