果胶是植物细胞初生壁的主要组成,而作为果胶结构中最重要和含量最高的多糖组分-同型半乳糖醛酸聚糖(Homogalacturonan,HG),在调控植物细胞壁的孔隙度、细胞伸长和粘附性等方面发挥着重要的生理功能。果胶HG前体在转运到细胞壁过程中,其甲酯化修饰程度(degree of methyl esterification,DM)由果胶甲酯酶(PME)家族介导催化完成,引起细胞壁的耐受力和机械性能的改变。研究发现,一种体内互作的小分子量的PME抑制子蛋白(PMEI)能够在翻译后水平调控PME活性,在维护果胶HG甲酯化修饰的稳态中发挥重要的枢纽作用,从而影响植物的生长发育、抗逆适应和内在免疫力的激活。目前,木本模式植物杨树的PMEI和PME家族编码基因的遗传学背景还未被揭示;逆境条件下,PMEI-PME互作微调果胶HG的甲酯化稳态的体内活性和在该框架下的分子调节机制,仍有待深入阐明。为探索PMEI-PME参与免疫防御和抗逆调节的生理学重要性,本研究在毛果杨的基因组中通过对PMEI和PME家族编码的基因结构、进化关系、表达模式、蛋白保守区和上游结合的调控因子等特征分析以及在致死性镰孢真菌Fusarium solani(Fs)处理条件下,应用转录组测序和代谢组学方法鉴定出Fs高响应的PMEI候选基因,同时构建目的基因过表达株系,并对其进行了初步的表型分析和功能性评估,主要研究内容和结果归纳如下:1.通过和拟南芥的同源基因序列的多重比对和进化关系分析,在毛果杨基因组中共筛选出49个PMEI(21个PMEI-I,20个PMEI-II和8个C/VIF)和70个PME(50个I型pro PME和20个II型PME)家族编码基因。根据染色体上的物理位置,对这些候选基因进行了命名和注释,并对基因结构、染色体分布、蛋白序列结构域和基序、靶向定位和理化性质等进行了预测。结果表明,PMEI家族基因无内含子,结构比较保守,N端含有质外体信号肽;PMEI-Ⅰ亚族与含有pro结构域的I型pro PME亚族成员处在一个进化分支,而和Ⅱ型PME显示与PMEI同源性较远。对PMEI和PME家族基因上游启动子序列分析发现,含有不同的激素、环境因子(如创伤、防御、低温和氧化胁迫等)和转录因子(TF)等相关结合的顺式调控元件。此外,结合数据库提供的转录组(RNA-seq)和实时荧光定量PCR(q RT-PCR)的评估,对PME和PMEI两个家族所有候选基因的不同组织表达模式进行了验证,结果显示共有7个PMEIs和8个Ptpro PMEs在根部表达具有高特异性,其中Pt PMEI28和Ptpro PME35的转录本分别在各家族中的丰度最高,而PMEI-II亚族基因和II型的Pt PMEs在发育组织中呈低表达或不表达水平。2.应用转录组学和代谢组学手段,在不同时段(0、24、48和72 hpi)Fs感染的毛果杨根组织中,对所Types of immunosuppression有诱导高响应的基因和糖类差异代谢物进行聚类分析。结合q RT-PCR实验法发现,和对照(0 hpi)相比,共有6个PMEIs(2个Pt C/VIFs和4个Pt PMEIs)和2个Ptpro PMEIs转录本对Fs侵染呈现高响应特征;这些PMEI转录本的差异变化更加显著,且和PME存在线性共表达模式。应用转录组图谱分析上游可能结合的共表达差异TF家族结果表明,编码ERF和MYB类的TF中,共有2个Pt ERF显著上调和1个Pt MYB显著下调,说明二者可能在上游参与调控PMEI-PME对Fs胁迫的防御响应。在相同条件下,对Fs感染的根中的代谢物进行非靶向检测,发现糖代谢通路在Fs防御的过程中富集,其中果胶含量明显下降和半乳糖醛酸(OG)含量显著增加,说明果胶HG在PME的作用下发生脱甲酯化产生OGs的结果,推测PMEI的表达下调参与调控PME活性增加产生对Fs的诱导响应。此外,转录组和代谢组联合分析结果显示,其中Pt PMEI28、Ptpro PME35和1个PR基因与水杨酸合成通路的代谢产物呈明显的负相关。3.根据基因表达的响应模式、酶活和差异代谢物的检测结果,筛选出显著下调的关键基因Pt PMEI点击此处28、Pt C/VIF1和2,进行遗传转化和体内活性评估。通过克隆三个基因的编码区(CDS)作为目的片段,连接到含2X35S启动子的p MDC32载体;再采用农杆菌(GV3101)介导法,分别对拟南芥和84k杨进行侵染转化,构建稳定遗传的目标基因过表达植株。经抗生素抗性筛选和q RT-PCR检测,最终分别确定三个表达量最高、稳定遗传的拟南芥植株和转基因84k杨树无性系,用于表型观察。相对于拟南芥野生型,Pt PMEI28(28-13、28-17、28-18)、Pt C/VIF1(1-1、1-2、1-7)和Pt C/VIF 2(2-1、2-5、2-7)的过表达导致植株的叶片面积减小;而Pt C/VIF1(1-2)和Pt C/VIF2(2-1)的过表达植株的种子产量显著减少。应用化学法对三个基因的突变体种子的钌红染色发现,Pt PMEI28(28-13、28-17、28-18)过表达家系的种皮黏液染色范围比野生型小,种皮黏液的释放受到了抑制。此外,相对于野生型杨树,基因过表达84k转基因杨树(28-3、28-6、28-10、1-8、1-12、1-14、2-1、2-3、2-7)均表现出株高和根长的显著变化。然而,突变体植株在不同逆境处LBH589抑制剂理下的生理发育和分子表型,还需更多的数据支持。综上所述,本研究在毛果杨中解析了PMEI和PME家族编码基因的分子和遗传背景;对在Fs侵染条件下PMEI-PME的高响应基因、上游可能结合调控的TF和代谢产物的相关性进行了探索。同时构建了目的基因过表达株系,初步探究了基因的过表达对拟南芥和84k杨树生长和发育的影响。研究结果为后续在林木中深入揭示PMEI-PME微调果胶HG的DM稳态,介导调控植物免疫防御的机理研究提供重要的的理论基础和策略参考。