D-丝氨酸(D-Ser)起到调节人类神经系统的功能,在医药领域,可以作为治疗由感染引起的肺结核病的药物中间体,可以用于治疗可卡因依赖症、精神分裂症。在化妆品领域,D-Ser可以作为活性物质添加到护肤品中。目前,合成D-Ser的主要方法普遍存在着污染环境、产率低等缺点。前期研究已经构建出了一条耦联来源于Proteus mirabilis的L-氨基酸脱氨酶(Pmir LAAD)、来源于Symbiobacterium thermophilum的D-氨基酸脱氢酶(StDAPDH)和来源于Burkholderia stabilis的甲酸脱氢酶(Bs FDH)的多酶级联路线,能够以廉价易得Brassinosteroid biosynthesis的L-氨基酸为底物,最终合成D-氨基酸。然而,上述酶及其多酶体系合成D-Ser的产率和光学纯度仍然有限。为了开发可用于高选择性合成D-Ser的氨基酸脱氢酶,并构建一条能够高效合成D-Ser的多酶级联体系,本研究开展了关键酶的分子改造和多酶体系构建优化研究,具体结果如下:(1)通过D-Ser合成关键功能酶的催化活性表征,确定了该多酶级联路线各模块所需要的模块酶,并对各模块的催化特性进行了考察,其中Pmir LAAD的Dorsomorphin最适温度为42°C,在温度>50°C时活性明显下降。当p H>7时,Pmir LAAD的催化活性一直处于较高状态,但是当p H<7时,活性则明显下降,因此Pmir LAAD适合在碱性条件下进行催化,且受到p H的影响较小。StDAPDH/H227V的最适p H为9.5,催化活性在35-50°C之间受到温度的影响较小,相对酶活较高。Pmir LAAD和StDAPDH/H227V催化的反应均无逆反应发生。Bs FDH在p H 7.0-10.5的碱性环境下催化活性随着p H的升高稍有下降,但变化不明显,一直处于较高的催化活性。在25-50°C内,Bs FDH的催化活性随着温度的上升而上升。经过考察,发现各模块酶的反应条件可以兼容。(2)通过分子改造提高了StDAPDH/H227V对中间体羟基丙酮酸的催化活性,从而提升了整个多酶级联路线的催化效率。利用分子对接预测了口袋中与底物结合的四个关键残基92D、122D、152M和253N,通过单点饱和突变获得4株活性明显提高的突变体D92E、D122W、M152S和N253Y,再进行迭代突变,最终获得一株D92E/D122W/M152S突变株,比活提高了8.11倍。利用分子动力学推测酶活性提高的原因可能与活性口袋大小的变化以及底物与关键残基之间分子相互作用的增强有关。(3)将氧化脱氨模块(Pmir LAAD)、还原胺化模块(StDAPDH/H227V/D92E/D122W/M152S)和辅酶循环模块(Bs FDH)进行组装,构建成多酶级联体系,考察其催化性能,以及对其他氨基酸的催化效率。为了能使该多酶级联路线生成D-Ser的Rapamycin试剂产率达到最大,本研究从p H、温度、酶添加比例等方面进行了调节优化,发现该路线在50 m M Tris-HCl缓冲液(p H 9.5)、甲酸钠浓度为100 m M、NADP~+浓度为2.5 m M、NH_4Cl浓度为100 m M、Pmir LAAD全细胞50 mg·m L~(-1)、StDAPDH/H227V/D92E/D122W/M152S纯酶4 mg·m L~(-1)和Bs FDH纯酶0.7 mg·m L~(-1),反应温度为32°C时达到最大催化效率,以50m M L-Ser为底物时,产率可以达到96.5%,ee值>99%。通过考察,发现该多酶级联路线还可以催化多种小分子D-氨基酸的合成,在工业上具有较大潜力。