氮是植物生长的必需营养元素之一,参与植物多种生理生化过程。一氧化氮(Nitric Oxide,NO)是重要的氮代谢产物,在植物生长发育、抗逆反应等生理过程中起到重要的调节作用。目前已知硝酸还原酶(NR)是植物体内主要的NO酶源;动物的一氧化氮合酶(NOS)催化精氨酸(L-Arg)直接合成NO,而植物中是否存在类似的NOS,还存在争议。拟南芥cue1-6(The Arabidopsis chlorophyll a/b binding protein gene underexpressed 1)突变体高积累内源NO,同时胞质中积累了大量磷酸烯醇式丙酮酸(PEP);而内源NO积累较少的noa1(The Arabidopsis NO-associated protein 1is absent)突变体中PEP含量减少。由此推测PEP或磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)可能与NO的合成有关。NR利用硝态氮合成NO,逆境胁迫也会诱导植物合成NO,但过多的NO会抑制植物生长,然而关于氮素与胁迫交互影响NO合成的研究却鲜有报道。本研究以野生型拟南芥、PEPC缺失双突变体(ppc1/ppc2)、NR缺失双突变体(nia1/nia2)拟南芥为材料,探讨不同氮素形态及氮水平结合逆境胁迫下的拟南芥生长发育、NO合成、PEPC和NR酶活性以及相关基因表达,研究PEPC参与NO合成的分子机制。本文主要研究结果如下:(1)PEPC具有NOS活性,催化L-Arg生成NO,该反应系统中PEP、Na HCO_3和NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)是必需的。该反应的酶动力学参数为:酶反应最大速度V_(max)=0.2 m M/mmedication overuse headachein/mg protein,米氏常数K_m约为180μM,最适Arg浓度为800μM。对noa1突变体和cue1-6突变体进行了PEPC酶活性测定,发现PEPC酶活与其体内NO含量成正相关。动物NOS抑制剂L-NAME(N-硝基-L-精氨酸甲酯)、AMG(氨基胍)和PEPC抑制剂L-苹果酸、L-天冬氨酸均能抑制PEPC的NOS活性,且具有浓度依赖性。(2)低氮促进拟南芥根系生长,高氮抑制其根系生长,高浓度NH_4~+则造成了铵毒害。低氮同时进行非生物胁迫处理,拟南芥体内会积累过量的NO,抑制植物生长。通过六种氮素处理,结果表明,与CK相比,1/2N、1/20N促进拟南芥根系生长,2N抑制根系生长。低浓度NH_4~+对拟南芥生长有促进作用,表现为主根长伸长、侧根数和根毛数增加;高浓度NH_4~+造成了铵毒害,表现为主根伸长受到抑制,鲜重、干重、含水量下降,丙二醛(MDA)含量和相对电导率增加。与CK相比,此网站其他氮素处理下拟南芥体内的NO含量显著增加,其中1/2 NH_4~+处理下最高。四种胁迫处理下,拟南芥体内的NO含量与对照相比显著增加,其中高光处理下最高。当氮素下降到1/20N时,同时进行胁迫处理,拟南芥体内会产生过量的NO。(3)四种非生物胁迫处理下,NR、PEPC的酶活均加强;PPC1、PPC2、NIA1、NIA2的表达都显著上调。与CK相比,1/2 NH_4~+处理下NR酶活和NIA1、NIA2基因的表达水平下降;PEPC酶活增强,但PPC1、PPC2基因的表达被抑制,而该处理下拟南芥体内NO含量显著高于对照处理,表明拟南芥体内存在依赖NR的NO合成通路和依赖PEPC的NO合成通路以及两者均不依赖的NO合BMS-354825成通路。(4)在1/20N、1/20 NH_4~+条件下,由于氮素的减少或者硝态氮的缺失,拟南芥体内通过NR途径合成的NO比例减少,分别为28.88%、20.42%;而通过PEPC通路合成的NO比例增加,分别为42.47%、51.55%;其他通路分别为28.65%、28.02%。与CK相比,胁迫处理下通过PEPC途径以及NR途径合成的NO增加。在冷、渗透胁迫下NR合成NO的比例更高,而在高光和盐胁迫下,PEPC合成NO的比例更高。综上,低氮同时进行胁迫处理,植物体会产生过量的NO,抑制生长,而正常的氮素供应可以减少胁迫下NO的过度积累。在农业生产上,可以通过遗传学手段筛选培育NO低积累材料,从而提高作物产量以及抗胁迫能力。