研究背景:钙化性主动脉瓣疾病(Calcific Aortic Valve Diseases,CAVD)是一种较为常见的瓣膜病变,由于瓣膜纤维钙化的发生,引起瓣叶活动功能受限,最终导致主动脉瓣狭窄并引发血流动力学障碍。明确疾病发生发展机制可以为疾病的药物治疗、早期发现提供可能,目前对于CAVD已经有相当基数的基础研究,然而仍无针对性药物或临床标志物可用于早期诊断及治疗,在CAVD研究领域还有许多未知等待我们去探索。CAVD的发展有损伤因素刺激,细胞间的相互做用,细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)的影响及复杂的免疫网络的调控,对于疾病发展的影响是多方面的,目前对于CAVD的研究主要是围绕瓣膜间质细胞(Valve Interstitial Cells,VICs)的成骨转化,VICs由原先的静止状态经由损伤因素刺激转化为激活形态VICs,其可以在激活型VICs的基础上进一步向成骨细胞分化。VICs的激活受多种因素调控,包括内皮损伤后细胞因子的释放,ECM的重塑以及瓣叶内其他细胞的作用等。在响应损伤微环境过程中,VICs被刺激转为化为更具有伸缩性的激活型VICs,而后又进一步分泌细胞因子,对瓣叶内其他细胞产生影响并促进ECM重塑。作为瓣膜纤维钙化病程早期的标志性细胞,其对于CAVD的调控是多方面的,其在早期病程中的具体作用值得我们去探索。纤维钙化重塑过程与免疫炎症反应存在复杂的关联网络,巨噬细胞(Macrophage,Mφ)、肥大细胞、淋巴细胞均参与了免疫炎症反应的调控。作为免疫反应中的重要一环,Mφ的趋化、粘附、极化等都与CAVD展密不可分。主要参与纤维发生以及慢性炎症反应的M2型Mφ在CAVD中的作用研究较少,其在早期病程中与激活型VICs的相互调控关系可能为CAVD的研究带来新方向。研究目的(一)明确瓣膜中激活型VICs对Mφ募集和极化的调控;(二)明确M2型Mφ激活VICs并促进其向成骨分化的作用机制;(三)在体内模型中明确激活型VICs和Mφ共同促进瓣膜纤维钙化的作用。研究方法(一)CAVD及对照患者的临床资料以及临床标本的采集对长海医院心脏外科2021年3月至2022年3月期间行主动脉瓣置换的患者15例以及同期行心脏移植手术的患者15例的基线期资料进行采集。将患者的主动脉瓣组织收集,通过H&E染色观察瓣膜基本形态变化;Masson染色观察瓣膜纤维化;茜素红染色、Von Kossa染色观察瓣膜的钙化情况;通过免疫组化染色观察瓣膜中VICs的激活情况以及Mφ的表达,通过Western-blot观察瓣膜中成骨相关蛋白的表达,通过q PCR观察成骨细胞或激活型VICs与Mφ的相关性persistent congenital infection。(二)猪主动脉瓣膜间质细胞(Porcine-Aortic VICs,P-AVICs)的分离提取鉴定以及激活诱导模型VICs的提取及鉴定:两步法分离P-AVICs,免疫荧光染色标记Vimentin,α-SMA以及CD 31,观察提取细胞的纯度。VICs的激AZD1152-HQPA分子式活诱导模型:将重组转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)以浓度梯度诱导VICs 3日后,免疫荧光染色观察α-SMA荧光信号强度,选取合适的诱导计量用于后续实验。Smad2/3/HA/CD44对于VICs激活的调控:Western-blot观察Smad2/3磷酸化水平在TGF-β1诱导后的表达变化,通过生物信息学分析GEO数据库中以同样手段处理的P-VICs中差异基因表达,通过Western-blot观察透明质酸合成酶2(Hyaluronan Synthetase2,HAS2)表达水平的变化。观察抑制Smad2/3通路、HAS2以及干扰透明质酸(Hyaluronan,HA)受体CD 44后VICs的激活情况变化。(三)激活型VICs对于Mφ募集及极化的调控Mφ迁移增殖:q PCR以及Western-blot实验观察激活型VICs中Mφ趋化因子表达的差异以及在抑制了AKT通路后相关趋化因子的表达差异。通过划痕实验及Transwell迁移实验观察Mφ在VICs激活后迁移能力的变化以及在抑制了AKT通路和相关趋化因子表达后的变化,通过Ed U、CCK-8观察相关刺激下Mφ增殖能力的变化。Mφ粘附:观察激活后的VICs中相关粘附分子的表达差异,通过细胞粘附实验观察细胞VICs激活后对Mφ粘附功能的影响以及抑制相关通路及粘附分子后的变化。Mφ极化:收集VICs条件培养基培养Mφ,通过流式免疫分型,Western-blot以及q PCR观察Mφ极化状态。(四)M2型Mφ对于VICs激活以及成骨转化的调控Mφ的极化诱导:通过IL-4诱导Mφ向M2型极化,并通过流式免疫分型和Western-blot观察诱导情况。对于VICs激活以及成骨转化的调控:通过条件培养及共培养方式观察M2型Mφ在对于VICs激活及成骨转化的影响,通过茜素红染色观察条件钙化培养基诱导钙化后VICs在不同培养时间内的钙化情况并通过Western-blot观察相关成骨标志物的表达差异。(五)体内实验观察CAVD模型小鼠在抑制VICs激活及清除Mφ后纤维钙化情况评价体内钙化模型建立:通过高脂饮食喂养Apo E-/-小鼠2月形成CAVD模型,通过超声观察CAVD的模型建立情况。组织学染色评价以及免疫荧光染色:Masson染色观察瓣叶的纤维化情况,Von Kossa染色观察瓣叶的钙化情况。通过HA与CD 44荧光染色观察ECM成分的变化,通过成骨相关蛋白及Mφ标志物共染观察抑制VICs激活及清除Mφ后钙化情况。研究结果(一)临床标本中纤维钙化发生情况及钙化纤维化与Mφ间的联系茜素红染色及硝酸银染色观察到CAVD中有明显钙化结节产生,免疫组化染色发现在CAVD中Mφ的表达以及VICs激活上调,Western-blot发现成骨细胞标志物及激活型VICs标志物表达在CAVD中升高,并且ECM中HA含量也上升。q PCR发现成骨细胞标志物与两类Mφ表达均存在相关性,仅M2型与VICs的激活及纤维发生相关。(二)P-AVICs鉴定及VICs激活诱导机制免疫荧光显示绝大多数分离提取的VICs均为Vimentin阳性细胞,仅可见少部分α-SMA荧光信号,未见CD31荧光信号。在TGF-β1浓度梯度刺激下,VICs成功激活,表现为α-SMA荧光信号强度的增加。Western-blot显示Smad2/3通路以及HAS2表达上升,将GEO数据库中同样处理的VICs进行差异表达分析,发现其中HAS2表达在TGF-β1诱导后显著上调,Elisa也提示HA在激活型VICs上清中表达上升。在抑制Smad2/3、HAS2以及干扰CD 44后,VICs激活受到抑制。(三)VICs激活后对Mφ的募集作用及极化影响q PCR显示在VICs激活后Mφ趋化因子CCL2以及CCL5表达升高,其中CCL5升高更为显著,Western-blot显示BMN 673小鼠在VICs激活后趋化相关通路AKT表达上升,并且在抑制了AKT通路后,CCL5的表达也被下调。迁移实验发现在VICs激活后Mφ迁移活动增强,并且在抑制AKT通路及干扰CCL5后被削弱,Ed U染色发现在短时间条件培养后Mφ增殖上升,CCK8结果显示在长期条件培养后Mφ增殖明显。VICs激活后CD 44表达上调,并且在抑制了Smad2/3、HAS2及CD 44后Mφ粘附功能减弱。在经激活型VICs条件培养基培养后,Mφ向M2型极化。(四)M2型Mφ促进VICs激活及加速其成骨分化在使用M2型Mφ条件培养基培养VICs后,发现相较于M0型Mφ条件培养基诱导相比,可进一步促进VICs的激活,共培养也提示M2型Mφ可促进VICs激活,在使用TGF-β1中和抗体后VICs激活被削弱。而M2型Mφ条件培养及共培养均不能直接导致VICs的成骨转化,随后以M2型Mφ条件钙化培养基诱导VICs钙化,茜素红染色和Western-blot均提示其可加速VICs的成骨转化。(五)抑制VICs激活和清除Mφ在高脂饮食Apo E-/-小鼠CAVD模型中减轻钙化进展超声结果显示Apo E-/-小鼠在高脂饮食喂养后出现主动脉瓣区峰值流速增加,在使用TGF-β1抑制剂以及同时清除Mφ后,主动瓣区峰值流速较CAVD组降低。Von Kossa染色显示CAVD模型小鼠主动脉瓣有明显钙化结节,在抑制TGF-β1及清除Mφ后,钙化结节较CAVD组减少,HA/CD 44表达也较CAVD组减少,成骨蛋白Runx-2以及M2型Mφ标志物CD 163表达也在相关处理后降低。研究结论CAVD病程中可以明显观察到纤维发生,并且ECM中HA含量也上升,慢性炎症反应即纤维发生过程中激活的VICs可促进Mφ的募集及向M2型极化,反之M2型Mφ可促进VICs的进一步激活,自此,过度激活的VICs会加速主动脉瓣纤维钙化的发生。