近年来,慢性代谢性疾病二型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)的发病率显著增加,而长期化学药物治疗的干预方式易产生不良副作用。基于此,食品衍生的活性多肽因其低副作用、来源广泛、高活性以及易吸收等特点,逐渐成为健康降血糖功能因子开发的新思路。通常,胶原蛋白因其具有较高含量的脯氨酸(Pro),是二肽基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ)抑制肽的潜在前体蛋白。当前,我国肉牛屠宰加工业发展迅速,牛皮副产物的产量稳步增长,牛皮胶原蛋白富含羟脯氨酸(Hyp)、脯氨酸(Pro)和甘氨酸(Gly),其水解物可能是潜在的DPP-Ⅳ抑制肽。本研究以牛皮胶原蛋白为基材,采用双酶酶解制备胶原基DPP-Ⅳ抑制肽;通过超声耦合离子液体修饰胶原蛋白,以促进胶原基DPP-Ⅳ抑制肽的释放;构建了T2DM小鼠模型,探究牛皮胶原肽干预方式对高脂/STZ诱发的小鼠血糖、血脂紊乱、胰岛素抵抗等的缓解作用并从AMPK介导的胰岛素信号通路和PI3K/Akt信号通路揭示了牛皮胶原肽改善胰岛素抵抗和糖代谢紊乱的作用机制;采集了小鼠盲肠内容物,解析牛皮胶原肽干预对高脂/STZ诱发的小鼠肠道微生态失衡及代谢紊乱的调节机制;以胶原肽为基材,辅以苦瓜提取物功能因子,制备出胶原肽-苦瓜提取物复合物以增加牛皮胶原肽的降糖靶点。因此,本文基于提取工艺优化、分离纯化及鉴定、结构表征、体外模拟消化、动物实验等手段,结合分子对接、固相合成、荧光淬灭、关键蛋白表达量测定、肠道菌群分析、代谢组学等技术,系统研究了胶原肽的降糖作用机制,为后续高效、灵敏、安全的降糖膳食补充剂的开发提供理论依据和参考,并强化牛皮的高值化利用途径。主要研究结果如下:1.探究了超声耦合离子液体辅助制备胶原基DPP-Ⅳ抑制肽的最佳工艺参数及有效肽段的氨基酸序列。在超声功率389 W,超声时间25 min,离子液体类型为[EMIM][Ac],离子液体/胶原蛋白0.7,胶原蛋白浓度0.3%,双水解酶酶解(木瓜蛋白酶与复合蛋白酶)时,牛皮胶原肽的IC_(50)值(3.04±0.18 mg/m L)明显低于传统方式制备的胶原肽,表明超声耦合离子液体提高了胶原肽的DPP-Ⅳ抑制能力。此外,超声耦合离子液体促进了牛皮胶原肽二级结构中β折叠向β转角的部分转化,并增强了胶原肽的胃肠道消化稳定性。分离纯化的GPVG,FGPGP,APGGAP,GPPGPT和GPVGPPG等肽段具有较强的DPP-Ⅳ抑制活性,抑制模式为非竞争性抑制,其中GPVGPPG的结合位点接近DPP-Ⅳ的C端,分子对接评分和常规氢键含量最高,合成肽IC_(50)值最低,表明GPVGPPG是源自牛皮胶原蛋白的有效DPP-Ⅳ抑制剂。2.系统分析了超声耦合离子液体预处理对胶原蛋白结构的修饰及其对DPP-Ⅳ抑制肽生成的影响。与未预处理的胶原肽相比,双重修饰(IL+US)明显提高了小分子量(<1 KDa)胶原肽的疏水氨基酸残基含量和DPP-Ⅳ抑制活性。同时,双重修饰降低了胶原的热稳定性,加速了胶原蛋白酪氨酸和苯丙氨酸残基的暴露,增加了相邻氨基酸残基沿螺旋结构中轴线的距离,并提高了胶原蛋白的溶解性,使得胶原蛋白表面变得粗糙,这增加了蛋白质和水解酶之间的反应位点,最终促进DPP-Ⅳ抑制肽的释放。离子液体和超声波分别倾向于促进氢键的断裂和抑制胶原蛋白之间的交联。研究结果表明超声耦合离子液体通过修饰胶原蛋白结构促进了牛皮源DPP-Ⅳ抑制肽的释放。3.解析了胶原肽干预胰岛素抵抗、糖异生及糖原合成的调控机制及其对T2DM的影响。胶原肽干预后,小鼠多饮、多食、体重减轻等症状明显减轻,较大程度缓解了胰腺、肝脏、肾脏和结肠部位的损伤,小鼠的空腹血糖和口服葡萄糖耐量明显降低、TC和LDL-C含量减少、而HDL-C含量增大(P<0.05),表明胶原肽干预通过调节血糖水平、改善血脂代谢紊乱和减弱器官损伤有效缓解了T2DM。此外,胶原肽干预后,小鼠血清胰岛素抵抗指数(HOMA-IR1)明显降低、肝糖原含量明显升高(P<0.01),小鼠肝脏中p-AMPK、IRS1和p-GSK3β蛋白表达明显上调(P<0.01),而PEPCK和Fox O1蛋白表达明显下调(P<0.05),说明胶原肽干预通过有效激活AMPK,上调胰岛素受体底物(IRS1)的表达调控胰岛素敏感性,并通过激活的IRS1激活Functional Aspects of Cell BiologyPI3K/Akt通路,上调p-GSK3β的表达以促进糖原合成,通过抑制Fox O1和PEPCK的表达抑制糖异生,降低了肝脏葡萄糖输出水平。4.探究了胶原肽干预对小鼠盲肠内容物微生物群和代谢产物的调控作用。胶原肽改善了T2DM小鼠肠道微生物群,与正常小鼠相比,高脂膳食及STZ引发小鼠肠道含有较Ras抑制剂高丰度的厚壁菌门、梭状芽孢杆菌门和乳杆菌属。胶原肽干预促使小鼠形成高丰度的变形菌门、拟杆菌门、类杆菌科和类杆菌属,同时产生与N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰甘露糖和唾液酸降解途径相关的乳酸杆菌属微生物群结构。胶原肽调控了T2DM模型小鼠的肠道微生物代谢,患病(T2DM)后,小鼠肠道氨基酸代谢物(酪氨酸甲酯、N-甲酰基-L-蛋氨酸和苯基乙酰甘氨酸)、脂肪酸和脂肪酸衍生物(胍基琥珀酸、水杨酸和9(S)-HPODE)、维生素类(生育三烯酚)、酮类物质(喹诺酮)、前列腺素F2a、6-甲基腺嘌呤和AMP明显增多,而胶原肽(CP)干预方式缓解了上述代谢物水平的增加;差异代谢物主要富集在类固醇激素生物合成、醛固酮的合成与分泌、癌症通路、脂肪细胞脂解的调控、c AMP信号途径、催产素信号通路、寿命调节通路、皮质醇的合成与分泌、醛固酮调节钠重吸收和前列腺癌等途径。5.探究了苦瓜提取物(MCE)复配对牛皮胶原肽的结构和功能特性的作用及其对T2DM的影响。复配MCE后,胶原肽的热稳定性、α-淀粉酶抑制活性、抗氧化活性和胃肠道消化抵抗力明显增强(P<0.05),CP与MCE之间的最佳比例为1:0.35,两者之间的荧光猝灭方式为静态淬灭,相互作用类型为疏水相互作用,说明MCE通过疏水相互作用增强了CP的稳定性、抗氧化性能及抑制碳水化合物吸收的能力。此外,与单一的CDinaciclib化学结构P干预相比,CP-MCE复合物明显改善了T2DM小鼠的血糖调节过程,降低了T2DM小鼠的空腹血糖和口服葡糖糖耐量,增强了胰岛β细胞的功能,增加了肝糖原含量,促进了糖原在肝脏和肾脏中的均匀分布并有效缓解氧化应激,结果表明与MCE复配后,明显增强牛皮胶原肽对小鼠T2DM症状的缓解。综上所述,以牛皮胶原蛋白作为高活性的降糖肽来源,分离出一种新的高DPP-Ⅳ抑制活性肽段GPVGPPG,超声耦合离子液体促进了DPP-Ⅳ抑制肽的释放,CP干预处理可通过影响AMPK介导的胰岛素信号通路及PI3K/Akt信号通路、重塑肠道菌群,调节肠道微生物代谢,缓解T2DM引起的血糖紊乱及胰岛素抵抗,此外,CP-MCE复合物可增加牛皮胶原肽的降糖靶点并提高胃肠道消化抵抗性。本研究揭示的牛皮胶原肽的降糖作用机制研究可为后续高效、灵敏、安全的降糖膳食补充剂的开发提供理论依据和参考,并强化牛皮的高值化利用途径。