甜瓜是重要的园艺作物,其分布范围广、栽培面积大、果实营养丰富。甜瓜起源于热带及亚热带广大地区DNA Damage/DNA Repair抑制剂,属于典型的喜温作物,对低温非常敏感。我国甜瓜常用于早春栽培,早春茬栽培模式利于甜瓜提早上市以获得更高经济价值。然而,我国北方地区“倒春寒”频发,极易造成甜瓜在苗期或定植初期遭遇低温侵袭,严重影响植株的正常生长发育,甚至造成果品上市期推迟,是制约我国甜瓜产业发展的重要因素之一。因此,挖掘甜瓜耐冷相关基因,研究其冷响应调控网络,为培育耐冷高品质甜瓜新品种奠定理论基础和提供优质基因资源。本研究以正向遗传学和多组学联合分析为切入点,挖掘调控甜瓜苗期耐冷以及权衡苗期耐冷与果实品质的关键基因,并对候选基因进行基因功能验证,分析其调控甜瓜耐冷的分子机制。具体研究结果如下:1.以耐冷甜瓜H581和冷敏感甜瓜H906构建的F_2和F_(2:3)群体为材料,通过对140个F_2进行dd RAD-Seq测序和基因分型,构建了一张包含12个连锁群、长度为1,462.3 c M的遗传图谱,平均标记间距为1.39 c M。结合两年两点共4个环境下的冷害指数作为性状指标进行甜瓜苗期耐冷QTL定位,获得了2个耐冷主效QTL(qCL3.1和qCL11.1)。分析qCL3.1和qCL11.1区段内基因的基因型变异,结合课题组前期转录组数据和文献报道,从qCL3.1和qCL11.1中分别获得21个和12个初步候选基因。进一步通过冷诱导表达分析,将Cmb ZIP53(MELO3C010967.2)和Cm RR14(MELO3C022469.2)作为重点候选基因。甜瓜中通过瞬时转化验证基因功能,Cmb ZIP53和Cm RR14均为甜瓜苗期耐冷的负调控因子。2.通过甜瓜全基因组扫描鉴定到18个Cm RRs,根据系统发育树分为A型、B型和PRR型。表达分析显示大多数Cm RRs具有组织特异性表达模式,部分Cm RRs受冷诱导表达。启动子分析发现Cm RRs启动子含多种逆境与激素相关顺式作用元件。利用VIGS方法验证Cm RR6和Cm PRR3基因功能,均是甜瓜苗期耐冷的负调控因子。荧光素酶互补实验表明Cm RR6和Cm ARF5存在蛋白间互作。3.qCL3.1中的候选基因Cmb ZIP53在亲本H581和H906中的编码区存在2个非同义突变。分别在拟南芥和甜瓜中对Cmb ZIP53的两个转录本的基因功能进行了分析。过表达Cmb ZIP53-H581/H906均降低了拟南芥和甜瓜耐冷性。表明Cmb ZIP53是甜瓜苗期耐冷的负调控因子,H581和H906的非同义突变并未对Cmb ZIP53基因功能造成影响。亚细胞定位显示Cmb ZIP53-H581和Cmb ZIP53-H906均在定位于细胞核,表达分析显示两者的表达模式相同,但表达量存在极显著差异。Y1H结果表明在酵母中两者均能结合Cm CBF1/2/3启动子全长和G-box元件,负调控报告基因表达。烟草中LUC结合实验进一步证明两者均能直接靶定Cm CBF1启动子,负调控报告基因的转录。Y2H和荧光素酶互补实验证明Cmb ZIP53与Cmb ZIP53/Cmb ZIP9形成同源/异源二聚体,调控甜瓜响应冷胁迫。启动子活性影响基因的表达水平,分析H581和H906中Cmb ZIP53基因启动子发现存在SNP和Indel的差异,其中H906-1,592 bp和-1,527 bp处SNP分别造成新增AE-Box和MYC顺式作用元件,H581中-67 bp处SNP造成新增TATA-Box元件。LUC实验检测启动子活性发现H581中Cmb ZIP53启动子活性高于H906中,表明H581中Cmb ZIP53本底表达水平低并非启动子活性导致。推测可能存在mi RNA造成H581和H906中Cmb ZIP53表达的差异是影响两者耐冷性的主要原因。4.采用GC-MS对8种不同耐冷性甜瓜材料的成熟期果肉进行了代谢谱分析,利用48种标样对果肉样品进行了靶向相对定量,共检测到31种初级代谢产物,包括12种氨基酸、10种有机酸和9种可溶性糖。发现耐冷型甜瓜中的大多数初级代谢产物普遍低于冷敏感型甜瓜,其中耐冷甜瓜H581和中等耐冷甜瓜HH09中代谢产物差异巨大。对H581和HH09中的代谢产物和转录组数据进行加权基因共表达网络分析,获得Y-276325个候选基因MELO3C016749.2(Cm WEB1)、MELO3C012147.2(Cm EAF7)、MELO3C026791.2(Cm WD40)、MELO3C010343.2(Cm SPX1)和MELO3C024337.2(Cm TMEM78B)。通过瞬时表达分析了重点候选基因Cm EAF7的功能,VIGS沉默Cm EAF7降低了苗期耐冷性;果实中瞬时过表达增加了果肉中蔗糖和果糖含量,沉默Cm EAF7则降低蔗糖和果糖含量,但均不影响葡萄糖含量。综上所述,本研究共挖掘到4个(Cmb ZIP53、Cm RR14、Cm RR6和Cm PRR3)甜瓜苗期耐冷负调控因子和1个甜瓜苗期耐冷与果实品质的“理想型”权衡基因(Cm EAF7),并通过拟南芥异源转化或甜瓜瞬时转化验证了基因功能。同时,研究了Cmb ZIMedian survival timeP53基因调控甜瓜耐冷的分子机制,发现Cmb ZIP53与Cmb ZIP53/Cmb ZIP9形成同源/异源二聚体,直接靶定Cm CBF1启动子抑制基因转录,从而负调控甜瓜苗期耐冷性。研究结果为甜瓜耐冷分子育种和协同改良育种提供了新的基因资源,为甜瓜耐冷调控网络研究奠定理论基础。