间充质干细胞来源外泌体(Mesenchymal stem cell exosomes,MSC-EXs)具有多重功能,包括抗炎、促增殖、促迁移、促成血管、促成骨等,是促进伤口愈合和组织再生的有效药物。然而,MSC-EXs作为治疗药物单独应用于体内时,面临着易被清除、半衰期短的问题,其治疗作用大打折扣。受生物素-亲和素相互作用的启发,本研究提出一种简便且通用的方法,利用生物素-亲和素系统将MSC-EXs锚定在水凝胶中,实现MSC-EXs的持续递送。首先,本研究通过羧氨反应利用N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯-聚乙二醇-生物素(N-hydroxysuccinimide ester-polyethylene glycol-biotin,NHS-PEG_(12)-biotin)在甲基丙烯酰化明胶(Methacrylated gelatin,Gel MA)侧链上接枝生物素,合成生物素化Gel MA(Bio-Gel MAVibrio infection)。随后,通过物理嵌入法利用二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-生物素(DSPE-PEG-biotin)将生物素嵌入MSC-EXs的磷脂双层膜,制备生物素化MSC-EXs(Bio-EXs)。准备好Bio-Gel MA和Bio-EXs后,通过亲和素将Bio-EXs锚定在Bio-Gel MA上,构建Bio-Gel MA@Bio-EXs水凝胶,测定MSC-EXs的缓释效能。结果显示Bio-Gel MA@Bio-EXs水凝胶在体外持续释放MSC-EXs,时间可达7天,在体内的缓释周期可达28天。最后,本研究通过大鼠牙周缺损模型验证该体系是否能增强MSC-EXs的治疗效果。结果显示,Bio-Gel MA@Bio-EXs水凝胶可再生复杂的牙槽骨-牙周纤维-牙骨质牙周组织复合体,治疗效果最好。此外,在牙周组织再生的过程中,Bio-Gel MA@Bio-EXs水凝胶表现出强大的免疫调控作用,可抑制缺损部位的巨噬细胞向促炎型M1型巨噬细胞极化同时促进其向抗炎型M2型巨噬细胞极化。本研究首次将生物素-亲和素系统应用于MSC-EXs缓释,增强MSC-EXs的疗效,推动MSC-EXs应用于再生的临床转化,为研发应用于组织再生和免疫调控的MSC-EXs功能化生物材料提供一种新策略。第一部分Bio-Gel MA的合成及表征【目的】合成Bio-Gel MA,优化合成条件,合成生物素化程度最高的Bio-Gel MA。【方法】1、利用NHS-PEG_(12)-biotin通过化学交联将生物素接枝到Gel MA侧链上合成Bio-Gel MA,通过透析纯化Bio-Gel MA。2、通过筛选反应时间和反应比例等条件合成生物素化程度最高的Bio-Gel MA。3、通过FTIR和H~1NMR检测NHS-PEG_(12)-biotin是否与Gel MA发生反应,生物素是否被成功接枝到Gel MA侧链上。4、通过倒置法、扫描电镜(SEM)和单轴压缩实验检测生物素化修饰是否会影响Gel MA的光交联性能、形貌结构和力学性能。【结果】1、生物素与Gel MA成功结合,透析24小时可去除多余NHS-PEG_(12)-biotin。2、当NHS-PEG_(12)-biotin与Gel MA反应时间为8小时,反应比例为20:1时,获得的Bio-Gel MA生物素化程度最高。3、FTIR和H~1NMR显示NHS-PEG_(12)-biotin与Gel MA之间发生了反应,形成了稳定的酰胺键,生物素被成功接枝到Gel MA侧链上,Bio-Gel MA合成成功。4、倒置法、SEM和单轴压缩实验证明生物素化修饰不影响Gel MA的光交联性能、形貌结构和力学性能。【结论】Bio-Gel MA合成成功并保留其原有的性能。第二部分Bio-EXs的制备、鉴定及功能验证【目的】制备Bio-EXs,优化制备条件,评估Bio-EXs的生物学功能。【方法】1、使用贴壁法分离培养大鼠原代骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs),通过流式细胞术和三系分化对提取到的细胞进行鉴定。2、使用超速离心法提取MSC-EXs,通过纳米粒子追踪分析(NTA)、western blot、透射电镜、纳米流式细胞术对提取到的MSC-EXs进行鉴定。3、使用梯度浓度二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-荧光素(DSPE-PEG-FITC)(10、20、50、100μmol/L)制备FITC修饰的MSC-EXs。使用梯度浓度DSPE-PEG-biotin(10、20、50、100μmol/L)通过原位自组装磷脂生物素化策略制备Bio-EXs。通过纳米流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测FITC或生物素修饰率。4、通过将PKH26标记的MSC-EXs或Bio-EXs与细胞共同孵育,检测生物素化修饰是否影响MSC-EXs被细胞摄取。5、通过LPS诱导RAW264.7巨噬细胞系建立体外细胞炎症模型。加入MSC-EXs或Bio-EXs后,通过实时定量逆转录聚合酶链式反应(Real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,q RT-PCR)、酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和免疫荧光检测MSC-EXs和Bio-EXs是否能调控巨噬细胞极化及生物素化修饰是否影响MSC-EXs的免疫调控性能。【结果】1、原代MSCs高表达间充质细胞标记物CD29,CD44和CD90,可向成脂、成骨和成软骨分化。MSC-EXs呈典型的杯状结构,粒径在40-220 nm之间,高表达EXs特征蛋白HSP70、CD63和TSG101。纳米流式结果显示MSC-EXs的CD63和CD81阳性率分别为56.16%和65.36%。2、DSPE-PEG-FITC和DSPE-PEG-biotin均可自组装到MSC-EXs的膜磷脂结构中,与梯度浓度DSPE-PEG-FITC(10、20、50、100μmol/L)孵育后,FITC阳性率分别为54.93%、70.19%、80.61%和84.19%。与梯度浓度DSPE-PEG-biotin(10、20、50、100μmol/L)孵育后,biotin阳性率分别为61.03%、80.20%、82.68%和84.19%3、MSC-EXs和Bio-EXs均可被巨噬细胞摄取,二者摄取率无明显差异。q RT-PCR结果显示,MSC-EXs和Bio-EXs处理后,M1极化相关基因(IL-1α、IL-1β和IL-6)的表达水平显著降低,M2极化相关基因(Arg-1和IL-10)的表达水平显著提高。免疫荧光染色结果显示,MSC-EXs和Bio-EXs显著降低M1极化相关蛋白(i NOS和CCR7)的表达水平,同时上调M2极化相关蛋白(CD206)的表达水平。ELISA结果显示,MSC-EXs和Bio-EXs显著降低M1极化相关细胞因子(TNF-α和IL-1β)产量同时提高M2极化相关细胞因子(IL-10)产量。【结论】原代MSCs被成功分离培养,MSC-EXs被成功提取,Bio-EXs被成功制备,生物素修饰率可达80%,且生物素化修饰不会影响MSC-EXs被细胞摄取。MSC-EXs和Bio-EXs均可抑制巨噬细胞向M1促炎表型极化,促进巨噬细胞向M2抗炎表型极化,二者的效果无显著差异,生物素化修饰不会影响MSC-EXs的免疫调控能力。第三部分基于生物素-亲和素系统耦合缓释MSC-EXs体系的构建【目的】通过亲和素将Bio-EXs锚定在Bio-Gel MA上,构建基于生物素-亲和素系统耦合缓释MSC-EXs的Bio-Gel MA@Bio-EXs水凝胶。【方法】1、以含未生物素化MSC-EXs和亲和素的Bio-Gel MA@EXs水凝胶为对照组,使用不同摩尔比(1:1、2:1、3:1)的Bio-EXs与Avidin制备Bio-Gel MA@Bio-EXs水凝胶,测定MSC-EXs缓释效能,从而探索生物素-亲和素系统对Bio-Gel MA@Bio-EXs水凝胶体系MSC-EXs缓释效能的影响。2、使用PKH26标记未生物素化MSC-EXs和Bio-EXs,将Bio-Gel MA@EXs和Bio-Gel MA@Bio-EXs水凝胶浸入PBS,将特定时间(1,4,7天)的荧光强度除以初始荧光强度来计算MSC-EXs的保留率(体外)。通过ELISA测定MSC-EXs的释放率(体外)。3、使用1,1′-双十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚三碳菁碘(Di R)(Ex750 nm/Em780nm)荧光标记未接枝生物素的MSC-EXs或亲和素偶联的Bio-EXs,将Bio-Gel MA@EXs和Bio-Gel MA@Bio-EXs水凝胶植入小鼠皮下,通过活体成像测定术后1,4,7,28天的Bio-Gel MA@Bio-EXs水凝胶中MSC-EXs的体内荧光强度。通过将特定时间(1,4,7,28天)的荧光强度除以初始荧光强度来计算MSC-EXs的保留率(体内)。4、使用PKH26标记未生物素化MSC-EXs和Bio-EXs,将Bio-Gel MA@EXs和Bio-Gel MA@Bio-EXs水凝胶植入皮下,7天后检测从材料中释放出来MSC-EXs的体内去向。5、皮下植入Bio-Gel MA@Bio-EXs水凝胶,28天后通过苏木精-伊红(HE)切片染色检测全身主要脏器和水凝胶E7080半抑制浓度周围皮肤组织的病理变化,评估Bio-Gel MA@Bio-EXs水凝胶的生物相容性。【结果】1、体外荧光图显示,第1天和第4天三组Bio-Gel MA@Bio-EXs水凝胶(Bio-EXs:Avidin=1:1、2:1、3:1)的体外荧光强度均显著高于Bio-Gel MA@EXs。第7天,Bio-Gel MA@Bio-EXs(2:1)和Bio-Gel MA@Bio-EXs(3:1)的荧光强度仍明显高于对照组Bio-Gel MA@EXs。2、ELISA结果显示Bio-Gel MA@Bio-EXs(2:1)组在第1天和第4天EXs释放量显著低于对照组Bio-Gel MA@EXs。3、活体成像显示在第1,4,7,28天,Bio-Gel MA@Bio-EXs(2:1)组的水凝胶体内荧光强度明显高于对照组Bio-Gel MA@EXs水凝胶。4、材料植入7天后,从Bio-Gel MA@EXs和Bio-Gel MA@Bio-EXs水凝胶中释放出来的MSC-EXs主要被体内巨噬细胞吞噬。5、HE染色结果显示水凝胶植入后,水凝胶周围存在纤维组织,内部有细胞长入,小鼠的主要脏器无明显的病理变化。【结论】Bio-Gel MA@Bio-EXs水凝胶具有良好的生物相容性。当Bio-EXs与Avidin的比为2:1时,Bio-Gel MA@Bio-EXs水凝胶可显著延长MSC-EXs的保留时间并持续释放MSC-EXs,释放出来的MSC-EXs主要被巨噬细胞吞噬。第四部分生物素-亲和素系统耦合缓释MSC-EXs促大鼠牙周再生【目的】通过评估Bio-Gel MA@Bio-EXs水凝胶促牙周组织再生和免疫调控效果,检测生物素-亲和素耦合缓释系统是否能增强MSC-EXs的疗效。【方法】1、建立大鼠牙周缺损模型,将大鼠随机分为四组接受不同处理:(1)空白对照组,不作任何处理;(2)Bio-Gel MA水凝胶;(3)含未生物素化MSC-EXs(50μg)的Bio-Gel MA@EXs水凝胶;(4)生物素-亲和素比例为2:1的Bio-Gel MA@Bio-EXs水凝胶(50μg MSC-EXs)。2、通过Micro-CT、HE染色和Masson染色检测术后28天大鼠牙槽骨-牙周纤维-牙骨质牙周复合体的再生情况。3、通过免疫荧光染色检测术后7天大鼠牙周缺损部位巨噬细胞极化情况。【结果】1、Micro-CT结果显示,术后7天,各组大鼠牙槽骨颊侧面有一3 mm×2 mm×1 mm大小缺损,均无新骨形成且组间无明显差异,大鼠牙周缺损模型成功建立。2、Micro-CT结果显示,术后28天,相较于空白对照组和Bio-Gel MA植入组,Bio-Gel MA@EXs植入组有明显新骨形成,骨小梁厚度(Tb.Th)显著升高,骨体积/总体积(BV/TV)显著上升,骨小梁分离度(Tb.Sp)显著降低。而相较于Bio-Gel MA@EXs水凝胶,Bio-Gel MA@Bio-EXs植入组的BV/TV和颊侧骨板厚度(BP.T)更高,在四组之中最高。3、HE和Masson组织学染色结果显示空白对照组和Bio-Gel MA植入组缺损区域仅见少量新骨和牙周纤维生成,充满结缔组织,Bio-Gel MA@EXs可见新骨和牙周纤维生成,但是其新形成的牙槽骨表面粗糙呈锯齿状,新形成的牙周纤维排列紊乱。而Bio-Gel MA@Bio-EXs组有更多的新骨形成,新形成的牙槽骨表面更加连续、光滑,新形成牙周纤维排列规则且更加致密。4、相较于空白对照组和Bio-Gel MA植入组,Bio-Gel AG-221化学结构MA@EXs组或Bio-Gel MA@Bio-EXs组缺损处的M1型巨噬细胞[诱导型一氧化氮合酶(i NOS)+/CD68+细胞]比例降低,M2型巨噬细胞(CD163+/CD68+或CD206+/CD68+)比例升高。而相较于Bio-Gel MA@EXs组,Bio-Gel MA@Bio-EXs组水凝胶M1型巨噬细胞(i NOS+/CD68+细胞)比例更低,在四组之中最低,M2型巨噬细胞(CD163+/CD68+或CD206+/CD68+)比例升高,在四组之中最高。【结论】MSC-EXs可促进牙周组织再生,抑制巨噬细胞向M1极化,促进巨噬细胞向M2极化。生物素-亲和素系统可通过缓释MSC-EXs显著增强其促牙周再生和免疫调控效果。