研究背景:骨质疏松症是一种以骨骼质量下降和骨细胞结构破坏为特征的慢性骨代谢疾病。全球人口中患有骨质疏松症的人数约为2亿人,其发病率已高于其它世界各种常见病。在我国,约有8800万人患有骨质疏松症,50岁以上的人群中骨质疏松症患病率为19.2%,其中女性比例为32.1%,男性比例为6.0%。65岁以上的人群中骨质疏松症的患病率达到32.0%,其中女性比例为51.6%,男性比例为10.7%。研究表明,在发生骨质疏松时,患者的牙槽骨最先被破坏,容易发生牙槽骨吸收,从而导致颌骨骨缺损。种植牙能最大程度地提高缺失牙患者的咀嚼效率,是修复缺失牙的首选方法。然而,骨质疏松症患者进行种植牙修复时,往往面临着骨量不足的临床难题。骨质疏松症患者骨代谢异常,严重影响骨植入物与自身骨组织的骨融合,增加了颌骨缺损修复失败的风险。因此,改善骨质疏松患者体内的骨代谢水平对骨质疏松型颌骨缺损的治疗具有重要意义。新骨的形成不仅取决于破骨细胞的骨吸收功能和成骨细胞的骨形成功能,还取决于这两种细胞凋亡率和存活率的差异。骨髓间充质干细胞(Bone marrowderived mesenchymal stem cells,BMSCs)数量及功能下降被认为是引起骨质疏松症患者骨量丢失的关键,也是颌骨缺损修复的关键。研究表明,骨质疏松症患者体内的骨代谢水平与氧化应激密切相关。骨质疏松症患者体内活性氧水平高,进而诱导成骨细胞和骨细胞的凋亡,抑制细胞的矿化和成骨。铁死亡是一种以活性氧升高和脂质过氧化为特征的新型细胞死亡方式,氧化应激状态下成骨细胞发生铁死亡会加速骨质疏松症的发生发展。因此,降低细胞内的氧化应激和铁死亡水平可作为调控成骨细胞功能的关键。目前,骨质疏medial geniculate松的治疗药物主要有雷洛昔芬、降钙素、双膦酸盐等,但长期服用会导致下颌骨坏死、消化道不良反应等。生育酚是一种较强的抗氧化剂,既往的研究也表明生育酚在抑制炎症、调节免疫、抑制破骨细胞增殖和分化等方面具有重要作用。本研究利用双氧水构建体外氧化应激损伤模型,探索生育酚对双氧水刺激的BMSCs细胞的作用,为改善氧化应激状态下BMSCs细胞的功能提供了新思路。研究目的:1.探索生育酚对双氧水刺激的BMSCs细胞活力、氧化应激和成骨分化的作用。2.探索生育酚是否通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制双氧水刺激的BMSCs细胞铁死亡从而维持细胞干性。研究方法:1.探究生育酚对双氧水刺激的BMSCs细胞活力、细胞内活性氧水平和成骨分化的作用1)采用不同浓度双氧水构建体外氧化应激模型,确定适宜的双氧水浓度。2)CCK8检测生育酚对氧化应激状态下BMSCs细胞活力的影响。3)ROS荧光探针和流式细胞分析检测生育酚对氧化应激状态下BMSCs细胞内活性氧水平变化的影响;Western Blot及qPCR技术检测生育酚对氧化应激状态下BMSCs细胞内抗氧化相关蛋白(NRF2和KEAP1)及mRNA(Nrf2,Cat,Sod-1,Sod-2)变化水平的影响。4)更换成骨诱导液与生育酚共培养后,采用碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红染色(ARS)观察生育酚对氧化应激状态下BMSCs细胞成骨分化的影响;Western Blot及qPCR技术检测生育酚对氧化应激状态下BMSCs细胞成骨分化相关蛋白(ALP和OPN)及mRNA(Alp,Opn,Runx2)变化水平的影响。2.探究生育酚是否通过抑制铁死亡促进双氧水刺激的BMSCs细胞成骨分化1)Western Blot及qPCR技术检测生育酚DNA/RNA Synthesis抑制剂对氧化应激状态下BMSCs细胞铁死亡相关蛋白(ACSL4,xCT,GPX4)及mRNA(Gpx4,Ptgs2,Ncoa4)变化水平的影响。2)激光共聚焦显微镜检测生育酚对氧化应激状态下BMSCs细胞铁死亡的影响。3)加入铁死亡的激动剂(Erastin)后,Western Blot及qPCR技术进一步检测生育酚对氧化应激状态下BMSCs细胞铁死亡相关蛋白(ACSL4,xCT,GPX4)及mRNA(Nrf2,Gpx4,Ptgs2,Ncoa4)变化水平的影响。4)加入铁死亡的激动剂(Erastin)后,Western Blot及qPCR技术进一步检测生育酚对氧化应激状态下BMSCs细胞成骨相关蛋白(ALP和RUNX2)及mRNA(Alp,Ocn,Opn,Runx2)变化水平的影响。5)加入铁死亡的激动剂(Erastin)后,采用碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红染色(ARS)观察生育酚对氧化应激状态下BMSCs细胞成骨分化的影响。3.探究生育酚是否通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制铁死亡促进双氧水刺激的BMSCs细胞成骨分化1)Western Blot技术检测生育酚对氧化应激相关信号通路蛋白(P-PI3K,PI3K,PAKT,AKT,P-mTOR,mTOR,P-AMPK,AMPK,P-ERK,ERK,P-P38,P38)变化水平的影响。2)加入铁死亡的抑制剂(Ferrostatin-1,Fer-1)后,Western Blot技术检测生育酚对氧化应激相关信号通路蛋白(P-PI3K,PI3K,P-AKT,AKT,P-mTOR,mTOR,PAMPK,AMPK,P-ERK,ERK,P-P38,P38)变化水平的影响是否与Fer-1效果一致。3)加入PI3K激动剂(740-YP)后,Western Blot及qPCR技术检测生育酚对氧化应激状态下BMSCs细胞铁死亡相关蛋白(ACSL4,xCT,GPX4)及mRNA(Gpx4,Nrf2,Ptgs2,Ncoa4)变化水平的影响。4)加入PI3K激动剂(740-YP)后,碱性磷酸酶(ALP)染色和茜素红染色(ARS)观察生育酚对氧化应激状态下BMSCs细胞成骨分化的影响。研究结果:第一部分:1.双氧水浓度为200μM时能够明显抑制BMSCs细胞活力。2.生育酚能够维持双氧水刺激的BMSCs细胞Liproxstatin-1价格活力,上调细胞内抗氧化应激相关蛋白和基因的表达水平。3.生育酚能够促进双氧水刺激的BMSCs细胞成骨活性,上调细胞内成骨相关蛋白和基因的表达水平。第二部分:1.生育酚能够抑制双氧水刺激的BMSCs细胞内铁死亡相关蛋白和基因的表达,且降低细胞线粒体内亚铁离子水平。2.生育酚通过抑制铁死亡上调双氧水刺激的BMSCs细胞成骨相关标志物的表达。第三部分:1.生育酚通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制双氧水刺激的BMSCs细胞内铁死亡水平。2.生育酚通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制铁死亡促进双氧水刺激的BMSCs细胞成骨分化。研究结论:生育酚通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制氧化应激状态下BMSCs细胞铁死亡从而维持细胞干性。