来自SDextrusion-based bioprintingR家族的短链醇脱氢酶(E.C.1.1.1.x;x=1或2,ADHs),也被称为酮还原酶(KREDs)或羰基还原酶(CRs),通过NAD(P)H烟酰胺环C4上的质子转移来催化醇与醛或酮类之间的相互转化。selleck产品基于其在温和条件下的高立体选择性,ADHs已被广泛研究并应用于手性醇的不对称合成。本论文拟研究利用ADHs催化底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮不对称还原制备替格瑞洛中间体(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇。通过基因挖掘和实验比较,确定来自Leifsonia naganoensis的醇脱氢酶ADH-E03在催化(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的不对称合成中显示出较高的活性。然而,野生型ADH-E03对底物的催化活力仍有待提高,且其对高浓度异丙醇的耐受性也有待改善。本论文结合定向进化和半理性设计策略对野生型ADH-E03进行分子改造,获得了 4个性能较优的三点组合突变体T100K/L207I/A7S、T100K/L207I/S105P、T100K/L207I/D107R 和 T100K/L207I/S148L,其比活力分别提高到了野生型的7.4、7.6、8.0和9.6倍。其中活力最佳的突变体T100K/L2071/S148L在热稳定性上的表现也最为优异,55℃处理30 min后的残余酶活与野生型相比提高了 5.7倍,并且在应用于500 g/L底物转化时显示出了最高的催化效率。选择最佳突变体为催化剂,进一步优化了其催化底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮不对称还原合成(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的反应条件,加入40g/L湿细胞和底物摩尔当量2倍的异丙醇,在50℃、pH 6.0以及一次性投料的方式下,无须额外添加辅酶NAD+,500 g/L底物酮不对称还原为产物手性醇的生物转化反应可在8 h内达到99.9%以上的转化率,且ee值超selleckchem Etoposide过99%。