植物器官脱落是普遍的生理现象,存在于植物体的整个生命周期,在农业生产中,脱落与农作物产量息息相关,是影响农作物产量和农民收益的重要因素,受到生物学家和农学家的广泛关注。植物器官脱落过程高度协调,在分子水平上,涉及各种内源性植物激素的相互作用,生长素作为一种重要的植物激素和关键的信号分子,在植物器官脱落进程中发挥重要作用。但目前关于植物内源生长素合成在脱落过程中的作用尚未见报道。吲哚-3-乙酸(IAA)是植物体中生长素的主要形式,IAA的生物合成途径主要可分为两种,一种是依赖于色氨酸的,另一种则是不依赖于色氨酸的,IAA的主要合成途径是其中依赖于色氨酸的合成途径,而吲哚-3-丙酮酸(IPy A)途径又是植物中这一类生长素合成方式中最主要的途径。YUCCA蛋白是IPy A途径最后一步催化IAA形成的关键酶。不同YUCCA家族基因成员具有T cell immunoglobulin domain and mucin-3多样的组织器官特异性表达,影响局部生长素的生物合成,在植物生长发育和环境变化应答中发挥重要作用。YUCCA蛋白还是植物中最早发现的一类含黄素的单加氧酶(FMO)蛋白,该蛋白中含有高度保守的FAD结合基序和NADPH结合基序,这两个结合基序是YUCCA蛋白的活性核心。在番茄中已报道了6个编码YUCCA-likBaf-A1e FMOs的基因(ToFZY1到ToFZY6)。在实验室前期的研究中,通过检测ToFZY4基因的表达,发现该基因的表达水平变化与花柄脱落过程紧密相关,推测该基因可能参与番茄花柄脱落过程。本实验以番茄为研究材料,从分子遗传、植物生理和生物信息学的角度展开研究,对番茄YUCCA家族基因ToFZY4的功能进行分析,主要实验结果如下:1.通过蛋白质序列的多重比对,确定ToFZY4基因编码蛋白重要结构域的位置,在此基础上,设计靶向ToFZY4基因关键位点的g RNAs。利用CRISPR/Cas9技术,构建ToFZY4的基因编辑载体,采用农杆菌(EHA105)介导的番茄转化,获得ToFZY4基因编辑突变体(tofzy4)。通过表型观察,发现ToFZY4参与番茄果实脱落过程,ToFZY4突变以后,番茄果实获得正常生长条件下的自主脱落表型。脱落过程节点基因表达水平变化分析表明,ToFZY4突变以后,果柄离区活性生长素水平下降;果柄离Puromycin molecular weight区局部生长素运输被抑制;细胞壁降解相关基因表达量升高;且在破色期时,tofzy4突变体离区中脱落进程已经启动。进一步的基因表达模式分析结果表明,ToFZY4在胎座、小柱、种子这些可能与果实-果柄间生长素运输相关的组织中皆有表达,且伴随着果实成熟,表达量逐渐升高;与此同时,ToFZY4在发育后期的果柄离区表达水平也有升高,但表达水平相对较低。2.构建ToFZY4的过表达载体,采用农杆菌(EHA105)介导的番茄转化获得ToFZY4过表达植株(ToFZY4-OE),并在DNA和RNA水平对遗传转化植株进行了阳性鉴定。目前已获得6株在RNA水平上表达量显著增加的ToFZY4-OE植株。3.选取ToFZY4基因ATG前3000 bp序列作为启动子分析区域,并对其启动区进行了预测,发现4个核心启动区。扩增得到两段启动子序列,其中ToFZY4-P2启动子区域长2591 bp,包含4个核心启动区;ToFZY4-P1启动子区域长2104 bp,包含3个核心启动区。以野生型番茄(Micro Tom)为遗传背景,构建p ToFZY4-1::GUS和p ToFZY4-2::GUS启动子GUS融合表达载体,采用农杆菌(EHA105)介导的番茄转化方法获得ToFZY4基因的启动子分析番茄转化植株。综上,本研究应用CRISPR/Cas9技术获得了tofzy4突变体,表型分析结果表明ToFZY4基因参与番茄果实脱落过程,且初步的基因表达水平分析结果表明ToFZY4突变可能主要通过影响果柄离区的生长素水平来影响果柄脱落过程。ToFZY4过表达植株与启动子分析植株的获得为后续ToFZY4基因调控果实脱落机理的研究奠定了材料基础。本研究结果为进一步解析植物器官脱落分子调控机理,研发植物器官脱落调节剂提供了理论支持。