刺激响应性纳米药物递释系统能在内源或外源性刺激下,实现靶标部位特异性响应,有效解决化疗药物系统毒性和生物利用度低的困境。缺氧是肿瘤病理微环境特征之一,缺氧环境中还原性酶及还原性物质高表达,为缺氧敏感响应纳米药物递释系统设计提供了契机。肿瘤及早诊治具有重要临床意义,但早期肿瘤缺氧条件不充分,并且缺氧环境具有异质性特点,导致缺氧敏感载体响应的选择性及灵敏度较低,影响疗效。为了提高缺氧敏感纳米药物递释系统体内响应的选择性及灵敏度,级联响应策略被提出以放大早期肿瘤部位和正常组织的差异,实现肿瘤组织快速敏感响应。本文致力于设计硝基苯级联响应缺氧敏感纳米药物递释系统,通过葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOx)及光动力治疗(Photodynamics Therapy,PDT)两种策略加剧早期肿瘤缺氧,激活级联缺氧响应,加速肿瘤部位特异性释药或增敏铁死亡,实现抗肿瘤增效目的。以6-氨基己酸为桥联分子,氨基端经酰化反应连接缺氧敏感响应分子对硝基biomimetic channel氯甲酸苄酯(P-nitrobenzyl chloroformate,PNZ-Cl),并通过酰胺反应将羧基端嫁接至荷正电的壳聚糖(Chitosan,CS),合成壳聚糖-硝基苯缺氧敏感嫁接物(ChitoTezacaftor MWsan grafted nitrobenzene,CS-PNZ-Cl)。以抗肿瘤药物米托蒽醌(Mitoxantrone,MIT)为模型药物,CS-PNZ-Cl疏水空腔包封MIT,同时通过CS-PNZ-Cl表面的正电荷静电复合荷负电的GOx,制备复合GOx的壳聚糖-硝基苯级联响应缺氧敏感载药纳米粒(GOx/MIT@CS-PNZ-Cl)。通过血液循环分布至肿瘤部位后,GOx作为启动级联反应的“钥匙”,催化葡萄糖氧化,生成H_2O_2,消耗氧气,加剧缺氧肿瘤微环境,上调缺氧微环境中硝基还原酶(Nitroreductase,NTR),激活GOx/MIT@CS-PNZ-Cl级联缺氧响应,快速释放化药MIT;产生的H_2O_2能通过调节还原性微环境,减少肿瘤细胞中的GSH,抑制GSH介导的多药耐药蛋白(Multidrug resistance protein,MRP)外排MIT,提高化疗药物疗效,有效联合GOx“饥饿疗法”与化疗,实现抗肿瘤增效目的。经测定,GOx/MIT@CS-PNZ-Cl粒径为157.0±5.2 nm,表面电位为0.2±0.4m V,MIT载药量和包封率分别为16.37%和86.19%。体外缺氧条件下,缺氧敏感载体粒径变化及载药纳米粒药物释放测定结果显示,CS-PNZ-Cl骨架在缺氧条件下快速解体,载体粒径快速减小并加快药物释放。通过体外测定H_2O_2浓度及p H值变化,显示GOx复合至CS-PNZ-Cl表面后,酶催化活性无明显变化。GOx催化葡萄糖氧化,能生成H_2O_2,降低细胞内GSH,抑制GSH介导MIT外排;同时,GOx酶催化生化反应消耗氧气,加剧缺氧,上调NTR表达,激活细胞内缺氧敏感纳米粒级联响应。建立小鼠4T1乳腺癌动物模型,活体成像显示CS-PNZ-Cl能有效分布至肿瘤。GOx/CS-PNZ-Cl能构建早期肿瘤缺氧微环境,放大早期肿瘤组织与正常器官的缺氧差异,有效激活CS-PNZ-Cl级联缺氧响应,实现肿瘤部位特异性释药。模型动物药效学实验结果显示,优选制剂GOx/MIT@CS-PNZ-Cl抗肿瘤疗效最强,抑瘤率达到89.45%,且具有较好的生物安全性。NTR催化缺氧敏感响应,该过程为电子接收反应,硝基苯缺氧敏感键被还原,同时消耗大量还原性磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NAPDH),导致GSH及还原性硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)抗氧化系统失衡,GSH及还原性Trx含量降低,影响谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPx4)/GSH及GPx4/Trx通路,进一步抑制GPx4活性,降低细胞抗氧化能力,增敏铁死亡。PDT过程消耗氧气,加剧缺氧,能作为启动缺氧级联反应的初始刺激。进一步的研究通过PEG将光敏剂二氢卟吩e6(Chlorin e6,Ce6)嫁接至CS-PNZ-Cl的壳聚糖链,制备二氢卟吩e6修饰壳聚糖-硝基苯级联响应缺氧敏感嫁接物(Ce6modified chitosan grafted nitrobenzene,Ce6-CS-PNZ-Cl)。近红外光照,Ce6-CS-PNZ-Cl光动力治疗,迅速生成大量ROS,降低细胞内GSH含量,抑制GPx4活性,降低细胞抗氧化能力,诱导铁死亡发生;同时,该过程消耗氧气,加剧缺氧,激活Ce6-CS-PNZ-Cl级联缺氧响应,选择性消耗NAPDH,进一步抑制GPx4活性,增敏铁死亡。铁死亡能够诱导免疫原性细胞死亡(Immunogenic cell death,ICD),释放损伤相关分子模式(Damage associated molecular patterns,DAMP),激活肿瘤免疫效应,有效联合PDT与免疫疗法,实现抗肿瘤增效目的。粒径检测及荧光共振能量转移实验结果显示,体外缺氧条件下,Torin 1半抑制浓度Ce6-CS-PNZ-Cl能快速解体,具备缺氧敏感响应特性。近红外光照,ROS探针检测Ce6-CS-PNZ-Cl诱导ROS生成能力,显示Ce6嫁接至CS-PNZ-Cl后,光动力效应无明显变化,近红外光照,Ce6-CS-PNZ-Cl的4T1细胞毒性远高于Ce6。缺氧探针检测结果显示,Ce6-CS-PNZ-Cl光动力治疗,消耗氧气,加剧细胞缺氧。考察Ce6-CS-PNZ-Cl缺氧响应增敏铁死亡机制,结果显示NTR催化的Ce6-CS-PNZ-Cl缺氧响应,选择性消耗NADPH,抑制GSH、Trx抗氧化系统,减少细胞内GSH、还原性Trx和总硫量,抑制下游GPx4活性,增敏铁死亡。检测GPx4表达、脂质过氧化物水平及线粒体膜电位,结果显示,Ce6-CS-PNZ-Cl光动力治疗产生大量ROS,降低GSH,抑制GPx4活性,降低细胞抗氧化能力,造成脂质过氧化物积累,诱导铁死亡发生;PDT过程加剧缺氧,激活级联缺氧响应,消耗NADPH,进一步抑制GPx4活性,增敏铁死亡,脂质过氧化物积累增加,线粒体去极化。铁死亡能够诱导ICD,释放高迁移率族蛋白B1(High-mobility group box 1,HMGB1)及钙网织蛋白(Calreticulin,CRT),激活肿瘤免疫效应。建立小鼠4T1乳腺癌动物模型,活体成像显示Ce6-CS-PNZ-Cl具有比游离Ce6更高效的肿瘤组织分布。模型动物药效学研究结果显示,给药系统Ce6-CS-PNZ-Cl抗肿瘤疗效最强。免疫学机制研究显示,Ce6-CS-PNZ-Cl可有效提高肿瘤部位DCs活化,诱导较强的T细胞免疫反应,显著减少M2型巨噬细胞及髓系抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cell,MDSCs),缓解免疫抑制性微环境。