背景缺血性中风是导致死亡和残疾的主要原因之一。在缺血性中风的病理过程中,星形胶质细胞发活化并产生形态和功能改变,命名为”反应性星形细胞”。活化后的星形胶质细胞分为”A1″和”A2″表型。硫化氢(hydrogen sulfide,H_2S)是体内广泛存在气体信号分子,不仅参与生理功能,也能影响病理过程。我们前期研究发现H_2S抑制脑缺血后星形胶质细胞反应性增生。但是H_2S是否影响星形胶质细胞表型转换未见明确报道。大电导钙激活钾通道(large conductance Ca~(2+)-activated K~+channels,BK_(Ca))由形成核心孔道的α亚基,以及辅助亚基β和γ组成。BK_(Ca)通道是神经活动的重要参与者,包括调节神经放电、控制神经递质释放、介导的小胶质细胞吞噬作用等。本课题组前期研究发现,H_2S激活BK_(Ca)通道保护神经元缺血/缺氧性损伤。H_2S激活BK_(Ca)通道是否影响星形胶质细胞表型转换,未见相关报道。因此,本课题通过建立小鼠脑缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)模型探讨H_2S和基于脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的神经炎症对脑R后星形胶质细胞表型转换的影响;构建星形胶质细胞氧糖剥夺/再给氧(oxygen and sugar deprivation/reoxygenation,OGD/R)模型,探讨BK_(Ca)通道的激活是否参与H_2S介导的星形胶质细胞表型转换。实验目的:1.研究脑I/R后基于脂多糖(LPS)的神经炎症对反应性星形胶质细胞转换转化的作用,并进一步探讨其与内源性Hmethylomic biomarker_2S的关系;2.通过培养星形胶质细胞OGD/R模型,探讨H_2S对体外反应性星形胶质细胞表型转换的影响;3.探索H_2S介导的反应性星形胶质细胞表型转换与BK_(Ca)通道激活之间的关系。实验方法:1.采用双侧颈总动脉(Bilateral common carotid arteries,BCCAs)结扎法构建小鼠I/R模型。并通过腹腔注射LPS(1 mg/kg/天)构建基于脂多糖的神经炎症模型。1.1实验分组:将野生型C57BL/6(wild type,WT)和CSE基因敲除(knock out,KO)小鼠分为以下几组(每组n=7组):WT小鼠假手术组,WT小鼠脑I/R组,WT小鼠脑I/R+Na HS(4.8mg/kg)组,WT小鼠脑部I/R+LPS(1 mg/kg)组,WT小鼠脑部I/R+LPS(1 mg/kg)+Na HS(4.8mg/kg)组,KO小鼠假手术组,KO小鼠脑部I/R组,KO小鼠脑部I/R+Na HS(4.8mg/kg)组。1.2旷场实验检测小鼠自发行为和运动探索能力。1.3Morris水迷宫实验(Morris water maze,MWM)测试小鼠空间学习和记忆能力。1.4采用HE染色法观察小鼠海马区神经元损伤情况。1.5 Western Blot检测GFAP,S100A10和C3的表达。1.6免疫荧光法检测Neu N、GFAP、S100A10和C3阳性细胞数。2.构建星形胶质细胞OGD/R模型。2.1实验分组:对照组、OGD/R组、OGD/R+Na HS(200umol/l)组、OGD/R+IBTX(iberiotoxin)(100nmol/l),OGD/R+IBTX(100nmol/l)+Na HS(200umol/l),和OGD/R+Fasudil(5umol/l)。在后续的实验中,我们又对对照组,对照组+BK_(Ca)开放剂BMS-191011(10umol/l)组,OGD/R组,OGD/R+BMS-191011(10umol/l)这四组进行了验证。2.2 OGD/R处理组的细胞被替换为无糖培养基并置于三气培养箱中(94%N_2-5%CO_2-1%O_2),低氧培养3.5 h,再更换高糖培养基置于恒温培养箱中进行24小时的复氧,建立OGD/R模型。2.3 cck-8试剂盒检测细胞活力。2.4使用ELISA试剂盒检测小鼠血清和培养星形胶质细胞上清液中的神经元特异性烯醇化酶(Neuron-specific enolase,NSE)活性和H_2S含量2.5Western Blot检测GFAP,S100A10,C3,PKA和BK_(Ca)alpha亚单位的表达。结果:1.旷场和水迷宫实验结果显示,与假手术组相比,脑I/R组的小鼠表现出明显的探索行为和空间记忆的障碍。而LPS处理的小鼠或CSE KO的小鼠在地点导航能力和空间探测能力方面的损害更为严重。外源性H_2S供体Na HS可以减轻LPS处理或CSE KO的小鼠脑I/R诱发的行为缺陷和认知功能障碍。2.HE染色、NSE测定和Neu N免疫荧光染色结果显示,与假手术组相比,脑I/R可诱导小鼠海马组织中神经元损伤。在LPS处理的小鼠中,脑I/R诱发的神经元损伤更为严重,可被Na HS改善。3.Western Blot结果显示,脑I/R诱导了小鼠海马组织中GFAP、C3和S100A10的表达增加(与WT假手术组相比,P<0.01);在小鼠海马组织中LPS处理促进脑I/R诱导的GFAP和C3蛋白的增加,降低S100A10的表达(P<0.05,与脑I/R组相比);而H_2S对脑I/R诱导的GFAP和C3在海马组织中的表达有抑制作用,无论是否用LPS处理。此外,在CSE KO小鼠中脑损伤引起的GFAP和C3蛋白的增加比WT小鼠更显著(P<0.05);Na HS处理可以抑制GFAP和C3的表达,但能促进CSE KO小鼠脑损伤后S100A10的表达。4.免疫荧光染色结果显示,LPS上调脑I/R诱导的小鼠海马组织中GFAP阳性细胞数和C3阳性细胞数的增加。Na HS处理抑制了脑I/R诱导的GFAP阳性细胞和C3阳性细胞在小鼠海马组织中的上调,并促进了S100A10的阳性细胞数的上调。5.在细胞实验中,Western blot结果显示,OGD/R上调了星形胶质细胞中GFAP和C3的表达,这可以被外源性的H_2S供体Na HS所抑制。H_2S处理也促进了S100A10的表达,提高OGD/R损伤后星形胶质细胞的活性和培养上清液中的H_2S含量。虽然100nmol/L IBTX不能影响OGD/R介导的反应性星形胶质细胞的增殖,也不能影响Na HSselleckchem Erastin对C3,S100A1AZD2281使用方法0和GFAP在星形细胞中表达的作用。但是OGD/R可降低星形胶质细胞中BK_(Ca)通道α亚基的表达,而补充H_2S可促进其表达,阳性对照药物Fasudil有相似的疗效。此外,H_2S可以上调BK_(Ca)通道α亚基、蛋白激酶A(PKA)的表达,而IBTX对此没有影响。6.在加入BK_(Ca)通道开放剂BMS-191011的细胞实验中,OGD/R诱导的星形胶质细胞中GFAP和C3表达的上调可以被BMS-191011抑制。BMS-191011对ODG/R后星形胶质细胞活力改变没有显著影响,但可上调S100A10在OGD/R星形胶质细胞和对照组细胞中的表达。结论:1.H_2S抑制脑I/R后神经炎症诱导的A1星形胶质细胞的增殖,并促进反应性星形胶质细胞向A2表型的转化。2.H_2S介导的反应性星形胶质细胞表型转换机制可能是与BK_(Ca)通道的上调有关。