水稻是世界上重要的粮食作物,由稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)侵染水稻引起的稻瘟病是重要的真菌病害之一,严重影响水稻产量和品质。在水稻生长季节,稻瘟菌通过分生孢子的致病性发育完成侵染循环,导致稻瘟病爆发和流行。目前,稻瘟菌分生孢子发育的分子机制研究取得了一定进展,但仍有一系列发育相关基因功能未知。针对病害侵染过程,解析稻瘟菌分生孢子生长发育相关功能基因,可为稻瘟病绿色防控提供新靶标和新思路。实验室前期对稻瘟菌的研究中筛选到了一个不产生分生孢子梗、不产生分生孢子,不致病的突变体,对该突变体进行转录组分析后与野生型相比得到了多个表达量降为0的基因,推测这些基因可能与稻瘟菌分生孢子的形成、发育和致病相关,本研究以其中一个功能未知基因(命名为MoCOS3)为对象,开展分子遗传学和植物病理学研究。通过构建MoCOS3基因敲除与互补菌株,进行了生物学和致病性分析,明确了MoCOS3在稻瘟菌分生孢子的形成、发育和致病中的作用;此外,本研究对MoCOS3基因进行了原核表达,纯化的蛋白具有诱发植物过敏性反应的现象,同时,MoCOS3蛋白可以分泌到植物中,诱导植物中病程相关蛋白的表达,显示出无毒效应蛋白特征。本研究取得的主要结果如下:1.构建了MoCOS3基因的敲除和互补菌株,明确了其亚细胞定位及时空动态表达情况。根据同源重组和随机插入的原理,利用农杆菌介导的遗传转化法,分别得到了4个MoCOS3的基因敲除菌株和3个互补菌株,为后续试验提供了材料;通过亚细胞定位预测和激光共聚焦显微观察明确了MoCOS3蛋白定位于线粒体中;对稻瘟菌各时期MoCOS3基因的表达进行实时荧光定量分析,得到MoCOS3基因在稻瘟菌分生孢子梗形成时期和病原菌侵染时期表达量显著上调,表明该基因可能在稻瘟菌分生孢子梗的形成、发育和致病过程中发挥作用。2.明确了MoCOS3基因的生物学功能。以MoCOS3基因的敲除、互补和野生型菌株为材料,分别对菌丝生长及菌落形态、分生孢子梗、分生孢子及黑色素产量、分生孢子萌发率、附着胞Functionally graded bio-composite形成率、附着胞膨压、有性生殖能力、菌落疏水性、细胞壁完整性、应对渗透胁迫的能力和清除外源过氧化氢的能力进行了系统分析,与野生型相比,MoCOS3基因缺失后,导致稻瘟菌分生孢子梗及分生孢子的产量均减少、分生孢子萌发速度减慢、黑色素量增加、附着胞膨压增高、疏水性增强、有性生殖过程子囊壳数目增加、清除外源过氧化氢的能力增强。进一步证实MoCOS3基因在调控稻瘟菌分生孢子梗形成、分生孢子Hydrotropic Agents抑制剂发育和附着孢成熟过程中扮演着重要角色。3.明确了MoCOS3基因缺失对稻瘟菌致病能力的影响。在以上研究基础上分别将稻瘟菌野生型菌株、突变体菌株以及互补菌株接种在水稻叶片和大麦叶片以及水稻叶鞘上,分析MoCOS3基因在稻瘟菌致病中的作用。结果显示,MoCOS3基因缺失突变体菌株对水稻和大麦叶片及水稻叶鞘的致病能力均增强,预示着MoCOS3基因在稻瘟菌致病过程中具有负调控作用。4.初步探明了MoCOS3基因负调控稻瘟菌致病的机理。本研究通过对稻瘟菌侵染后的水稻叶鞘细胞进行DAB染色,以研究MoCOS3基因缺失对稻瘟菌诱导植物产生防御反应能力的影响,结果表明MoCOS3基因缺失后,稻瘟菌诱导植物产生防御反应的能力减弱;并以带有红光融合蛋白的互补菌株为材料,观察侵染过程中MoCOS3的分泌情况,同时将原核表达并纯化得到的MoCOS3蛋白分别注射烟草和水稻后验证了烟草的HR反应和水稻中病程相关蛋白的表达。结果显示,在稻瘟菌侵染植物的过程中MoCOS3蛋白可以分泌到植物细胞中从而引发植物的HR反应,同时诱导植物中病程相关蛋白的表达,揭示了MoCOS3蛋白可能作为一种潜在的无毒效应蛋白而诱导植物抗性的机制。综上所述,本研究明确了MoCOS3基因在稻瘟菌分生孢子梗和分生孢子的发育及其致病过程中发挥着重要作用,初步揭示了MoCOS3蛋白可能作为一种候选的无毒效应蛋白来激发植物的免疫反应,从而提高寄主植物对稻瘟菌抗性的机制,为稻瘟病绿色防控提ABT-263研究购买供新靶标和新思路,同时为稻瘟菌中无毒效应蛋白的研究提供了理论基础。