糖类在各种生物过程中发挥结构或功能作用,是自然界最丰富的生物聚合物。由于单糖残基和连接键的特殊性质,糖链比核酸、蛋白质更加多样化、复杂化且常有分支结构。通过化学合成、酶法合成及两者结合获得结构均一的寡糖、聚糖及其缀合物可以有效促进糖类化合物结构和功能研究,同时也是其应用于医药等领域的基础。近年来酶法及化学酶法糖合成蓬勃发展,不断取得突变性进展。其中,Leloir型糖基转移酶是酶genetic reversal法糖合成最常用的工具酶,但由于需要以昂贵的糖核苷酸为供体底物,限制了糖基转移酶在规模化糖合成中的应用。此外,虽然酶促糖合成反应是一个可持续、环境友好且高效的过程,但是,该方法存在一定的局限性,如ATP依赖性激酶需要辅因子ATP以及合成反应消耗纯化的酶等,成本高、费时费力且不可重复利用,这些局限性导致酶促糖合成难以实现规模化应用。因此,亟需开发高效、低成本的糖合成方法来规模化制备功能性寡糖。课题组前期建立了糖苷磷酸化酶催化寡糖合成体系,以单糖激酶合成的糖-1-磷酸为供体底物,不需糖核苷酸即可高效合成简单寡糖。在此基础上,本论文以人乳寡糖组分乳酰-N-二糖(lacto-N-biose,LNB)Smoothened Agonist小鼠的合成为例,在单糖激酶和糖苷磷酸化酶催化的合成体系中,引入聚磷酸盐激酶(polyphosphate kinase,PPK)催化的辅因子ATP再生模块,并优化LNB合成条件。最终,在不添加外源ATP和糖核苷酸的情况下,利用Erysipelotrichaceae bacterium来源的 PPK12(EbPPK)、Bifidobacterium infantis来源的半乳糖基-β1,3-N-乙酰基-D-己糖胺磷酸化酶(BiGHNP)以及Bifidobacterium longum来源的半乳糖激酶(GalK),主要以简单单糖和聚磷酸盐为底物,制备了克级LNB,收率达92%。LNB的成功制备,验证了糖苷磷酸化酶联合ATP再生制备寡糖的可行性。进而我们将ATP再生反应分别偶联7种糖苷磷酸化酶,在不添加外源ATP的情况下,制备了半乳酰-N-二糖、N,N’-二乙酰基壳二糖及其衍生物、蛋白N-聚糖核心三糖衍生物及β1,2-、β1,3-和β1.4-在内的6种天然β-甘露糖苷MK-4827 IC50,收率在40%-91%,多数产物收率在50%以上,部分可达到80%以上。此项工作建立的三酶联合寡糖合成体系克服了生物酶法合成寡糖过程中需要昂贵供体和辅因子ATP等问题,步骤简单、经济高效,有望应用于一些重要寡糖或多糖的规模化制备。随后为了进一步降低寡糖合成成本,解决酶的可重复利用问题,我们以LNB合成相关酶即EbPPK、BiGHNP和GalK为例,进行酶或重组细胞的固定化研究。首先使用聚丙烯酰胺包埋法,比较了单独固定化酶与共固定化酶、共固定化酶与共固定化细胞的活性,结果发现共固定化酶优于单独固定化酶而共固定化细胞则与共固定化酶活性相当。进而,比较三种固定化方法即聚丙烯酰胺包埋法、钙离子-海藻酸钠包埋法和CLCAs(cross-linked cell aggregates,交联细胞聚合体)固定法的效果并探究三种方法的最适共固定化条件。最终,在优化后的共固定化条件下,成功制备了可循环利用的共固定化细胞,其中聚丙烯酰胺包埋法和CLCAs固定法共固定化细胞均可循环6个批次以上,钙离子-海藻酸钠包埋法共固定化细胞机械强度差,只能循环3个批次。从形状、强度、制作方法等方面比较三种方法,发现CLCAs固定法更有优势,该方法蛋白固定率高且操作简单,为将辅因子再生联合糖苷磷酸化酶合成体系开发成更加绿色经济的寡糖制备方法奠定了基础。总之,本论文围绕酶法糖合成开展了两方面工作:第一,建立了糖苷磷酸化酶联合ATP再生的寡糖酶促合成体系,在不添加昂贵供体底物和外源ATP的情况下,以单糖和聚磷酸盐为简单底物合成了多种功能性寡糖,如人乳寡糖组分、黏蛋白型O-聚糖核心结构、念珠菌抗原寡糖及蛋白N-糖苷核心寡糖等;第二,以LNB合成相关酶为例,进行了生物催化剂固定化研究,对三种常用固定化技术进行了性能比较,成功制备了无需纯化、可重复利用的固体生物催化剂即共固定化细胞,为后续研究奠定了基础。