查尔酮还原酶(Chalcone Reductase,CHR)主要来源于豆科植物,属于醛酮还原酶(Aldo-keto Reductase,AKR)超家族成员。CHR与查尔酮合成酶(Chalcone Synthase)共同催化生成一系列查尔酮类衍生物,是豆科植物异黄酮类天然产物生物合成途径关键酶。但目前为止有关CHR的体外独立的催化功能及其确切的底物谱未见报道。来源于紫花苜蓿(Medicago sativa)的查尔酮还原酶(MsCHR)为AKR4A亚家族成员,是目前唯一晶体三维结构已获解析的查尔酮还原酶,MsCHR折叠为典型的AKR家族(α/β)8桶状结构,并保留了 AKR家族特征性催化四分体Asp53-Tyr58-Lys87-His120及典型的辅因子结合位点。但与其他CHR一样,MsCHR确切的催化功能、底物口袋及底物类型均尚未明确。根据查尔酮还原酶主要与查尔酮类天然产物的生物合成相关的文献报道,本论文以MsCHR与NADPH复合物晶体三维结构为模板,选取16种结构不同查尔酮类化合物,首先利用分子对接方法虚拟筛选MsCHR具有转化潜力的化合物;进一步经酶转化活性检测发现,MsCHR可选择性催化还原查尔酮类化合物的碳碳双键,生成相应的二氢查尔酮,确定MsCHR为查尔酮类化合物双键还原酶;成功筛选到8种可被MsCHR催化还原的化合物,包括查尔酮、4-氟查尔酮、4′-氟查尔酮、4′-氯查尔酮Lorlatinib供应商、4′-羟基查尔酮、4′-甲氧基查尔酮、4-硝基查尔酮及柚皮素查尔酮,其中4′-氯查尔酮为MsCHR的最佳底物,其相对活性为查尔酮的236%;并进一步经摸索确定了 MsCHR催化反应最佳pH值为8.5,最佳温度为30℃。由于查尔酮类化合物的水溶性较差,无法达到测定酶催化动力学所需的浓度,因此本论文未能测定MsCHR对各底物的催化动力学数据。二氢查尔酮类化合物具有抗炎、抗肿瘤、抑菌及降血糖等作用,是一类极具开发前景的生物活性物质,主要通过选择性还原查尔酮类化合物的双键合成。但查尔酮类化合物为α,β-不饱和羰基化合物,选择性还原其双键需要以过渡金属有机复合物为催化剂,不仅价格昂贵,而且反应条件严苛、易污Mangrove biosphere reserve染环境,较难工业化应用,开发新型绿色高效的选择性还原查尔酮类化合物双键的催化剂具有重要意义。因此,MsCHR具有选择性催化还原查尔酮类化合物双键功能,在绿色合成二氢查尔酮类化合物领域具有一定的应用前景。为进一步提升MsCHR在选择性催化还原查尔酮类化合物领域的应用价值,本论文采用半理性设计策略,以查尔酮为模式底物,筛选https://www.selleck.cn/products/Nolvadex.html高效催化还原查尔酮双键突变体:在分子对接模拟底物与MsCHR结合的基础上,预测His120和Trp121为查尔酮双键结合关键位点,对两个位点进行饱和突变,共获得38种突变体,32种突变体的活性比野生型显著提高,W121T和H120L为活性最佳突变体,对于查尔酮的双键还原催化活性分别提高了 24倍和20倍,相对活性为野生型的2495%和2067%;仅6种突变体的活性呈下降,其中H120E活性最弱,仅为野生型的7%,几近失活。为阐明120和121位对MsCHR催化活性的影响机理,本论文采用分子对接和分子动力学模拟结合的方法,对MsCHR突变体与辅因子及底物的结合模式进行比较分析,发现120位的突变主要是通过改变NADPH的结合构象,影响NADPH稳定性,从而影响MsCHR的活性;而121位虽不与NADPH直接作用,推测该位点的突变可能通过影响相邻残基的构象,从而影响辅因子与底物的结合,对酶的活性产生影响。由于分子动力学模拟过程中,底物无法与120和121位突变体稳定结合,因为本论文未能明确120和121位突变对底物结合的影响,需通过其他手段进行研究。本论文的研究明确了紫花苜蓿查尔酮还原酶为查尔酮衍生物双键还原酶,增加了由柚皮素查尔酮还原生成根皮素的分支途径,丰富了黄酮类天然产物次生代谢网络;MsCHR也是目前AKR超家族中除AKR1D亚家族外,唯一功能明确的双键还原酶,对于研究异黄酮生物合成途径及AKR超家族的生物学功能及分类都具有重要意义。同时,利用半理性设计,成功获得了 MsCHR催化活性最高提高24倍的突变体,为其在选择性还原查尔酮衍生物双键的应用奠定了基础。