甘蓝型油菜是我国乃至全世界重要的油料作物之一,由野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.Campestris,Xcc)引起的黑腐病严重影响油菜作物的生产和发展,植物抗病和育种是控制病害的有效途径。紫黄质脱环氧化酶(Violaxanthin de-epoxidase,VDE)是叶黄素循环过程中关键性的酶,能影响ABA合成前体紫黄质的形成。而ABA作为重要植物激素,在抗病方面发挥着巨大功能,提示VDE参与抗病的可能性。油菜VDE含三个保守结构域,分别为N-末端富半胱氨酸结构域、脂质转运蛋白结构域和C-末端富谷氨酸结构域,具有两个同源拷贝,将其命名为BnaA06.VDE和BnaC05.VDE。本课题聚焦于油菜紫黄质脱环氧化酶VDE,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对BnaVDE进行突变,探究Bnavde在油菜与黑腐病菌互作中的功能。主要研究结果如下:(1)BnaVDE响应黑腐病菌和外源激素。采用qPCR对BnaVDE表达进行分析,发现甘蓝型油菜接种黑腐病菌后,BnaA06.VDE和BnaC05.VDE均显著上调表达。此外,GW-572016水杨酸(Salicylic acid,SA)、茉莉酸(Jasmonic acid,JA)和脱落酸(Abscisic acid,ABA)三种激素处理均可以诱导BnaA06.VDE和BnaC05.VDE表达。说明油菜BnaVDE响应黑腐病菌表达,并可能在SA、JA以及ABA介导的信号途径中起作用。(2)BnaVDE在油菜茎叶中高表达。实验室前期研究发现BnaA06.VDE和BnaC05.VDE在野生型油菜的根、茎、叶、花等组织器官中均有表达。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了BnaVDE缺失单突变体,分别为BnaA06.vde和BnaC05.vde。qPCR结果显示BnaA06.VDE在BnaC05.vde的茎叶中高表达,BnaC05.VDE在BnaA06.vde的茎叶中高表达,且BnaA06.VDE和BnaC05.VDE均在相互单突变体的叶片中表达量最高。(3)BnaVDE参与油菜对黑腐病的抗性。采用剪叶和喷菌两种接种方式,发现BnaA06.vde和BnaC05.vde单突变体植株的病害症状明显,发病程度显著高于野生型,表明油菜BnaVDE突变对黑腐病的抗性减弱。利用DAB染色和qPCR分析,观测到BnaA06.vde和BnaC05.vde单突变体油菜中H_2O_2积累减弱,Rboh D和Rboh F基因表达量下降。台盼蓝染色显示BnaA06.vde和BnaC05.vde单突变体在黑腐病菌接种后,死细胞更多,因此BnaVDE通过调节H_2O_2积累正调控油菜对黑腐病菌的抗temporal artery biopsy性。(4)BnaVDE突变影响ABA相关基因表达。为进一步探究BnaVDE介导的油菜对黑腐病菌的抗性与激素信号的相关性,采用qPCR对SA合成基因ICS1、SA受体基因NPR1、JA通路基因PDF1.2和MYC2、ABA生物合成基因NCED3和ABA受体基因PYL1在野生型和突变体油菜接种Xcc后进行分析。结果显示相较于野生型油菜,BnaA06.vde和BnaC05.vde单突变体油菜中NCED3和PYL1表达量下降,而ICS1、NPR1、PDF1.2和MYC2表达无显著差异,说明MCC950研究购买BnaVDE可能通过调节ABA信号介导油菜对黑腐病抗性。综上,BnaVDE通过调节H_2O_2和ABA信号正调控油菜对黑腐病的抗性,为解析油菜抗黑腐病的机理和油菜抗病育种提供参考。